ABC | Volume 114, Nº2, Fevereiro 2020

Artigo Original Stefani et al. Dano em DNA e insuficiência cardíaca Arq Bras Cardiol. 2020; 114(2):234-242 Coleta de Tecidos Os animais foram sacrificados por overdose de infusão intravenosa do pentobarbital anestésico (80 mg/kg i.p.). 16 Depois disso, foram removidos os pulmões, o diafragma, o gastrocnêmio direito, o sóleo direito e o coração. O ventrículo esquerdo foi separado do ventrículo direito para o ensaio cometa. Todas as amostras foram armazenadas a –80°C para análise posterior. Determinação de tamanho do infarto, hipertrofia cardíaca e congestão pulmonar e hepática Os corações foram removidos e pesados, sem sangue dentro da câmara e sem átrios. O tamanho da área de infarto foi determinado por planimetria. 17 Para avaliar a hipertrofia cardíaca, a massa de órgãos foi expressa como uma proporção da massa corporal (massa de tecido/massa corporal - mg/g). 18 Foram considerados ratos que desenvolveram insuficiência cardíaca os animais com hipertrofia ventricular direita (ou seja, relação massa corporal/peso do ventrículo direito > 0,80 mg/g). 12 Para determinar a congestão pulmonar e hepática, os pulmões e o fígado de cada animal foram removidos, pesados e desidratados (80°C) por 48 horas e depois pesados novamente para avaliar a porcentagem de água. Eletroforese em gel de célula única (SCGE) A eletroforese em gel de célula única (SCGE) foi realizada em condições alcalinas (pH> 13,0). 19 Todos os procedimentos foram realizados evitando qualquer incidência direta de luz. Para o ensaio, uma suspensão celular do tecido (ventrículo esquerdo, pulmões, diafragma, gastrocnêmio direito e sóleo direito) foi realizada em tampão PBS (pH = 7,40) com homogeneização manual padrão e suave. Essa etapa exigiu a observação da densidade das células que seriam usadas em cada lâmina. A câmara de Neubauer foi usada para contar aproximadamente 7,3 x 10 5  células/lâmina. A suspensão de células (40 μl) foi adicionada à agarose de baixo ponto de fusão (90 μl). Após ser misturado delicadamente, esse material foi cuidadosamente depositado sobre uma lâmina previamente coberta com uma fina camada de gel de agarose com uma lamela, e mantido em uma câmara úmida a 4°C por 10 minutos, a fim de garantir ainda mais a suspensão das células teciduais no gel. Em seguida, a lamela foi cuidadosamente removida e a lâmina foi condicionada em uma cubeta vertical contendo solução de lise por pelo menos 1 hora a 4°C. O passo seguinte consistiu no desdobramento das células por 30 minutos em um tampão alcalino (pH > 10,0). Posteriormente, foi iniciado o processo de eletroforese, onde as células lisadas contidas no gel de agarose foram submetidas a uma voltagem de 25 mV e 300 mA por 15 minutos em solução tampão alcalina (pH > 10,0). Em seguida, a placa foi neutralizada, corada com nitrato de prata, lavada e mantida em temperatura ambiente para secagem e análise posterior. As lâminas de cada animal foram feitas em duplicado e um controle positivo de danos ao DNA com peróxido de hidrogênio (30 µl/lâmina). A análise foi realizada sob um microscópio óptico com um aumento de 20x, quantificando o tamanho da cauda do cometa em 50 a 100 células, de acordo com os comprimentos, diâmetros, raios e dimensões de cometas individuais. Porcentagens de DNA da cauda, momento da cauda e momento da cauda de Olive foram utilizadas como parâmetros de quantificação de danos. Quantificação de danos no DNA Todos os parâmetros apresentados na sessão de resultados referentes ao SCGE foram calculados pelo software CASP (CASP Labs®, Polônia). 20 A porcentagemde DNA na fórmula da cauda, momento da cauda emomento da cauda deOlive está disponível para consulta nos dados complementares. Omomento da cauda é caracterizado como o produto do comprimento da cauda e a porcentagem de DNA na cauda. O momento da cauda de Olive, que é outro parâmetro para dano ao DNA, compreende o produto da distância (relativa ao eixo x) entre o centro de gravidade da cabeça e o centro de gravidade da cauda do cometa e a porcentagem de DNA da cauda. Tamanho da amostra e análise estatística Para uma diferença mínima de 23 unidades arbitrárias de momento da cauda de ± 4 DP, foi possível determinar a diferença estatística mínima de dois grupos com três animais cada. 21 Em nossa investigação, decidimos usar seis animais em cada grupo. Os dados são apresentados em média ± DP. O teste de normalidade de Shapiro-Wilk foi utilizado para avaliar a distribuição das variáveis. Para comparações entre os grupos, um teste t de Student não pareado e uma análise de variância bidirecional foram realizados entre os diferentes tecidos com um teste post hoc de Tukey. Foi considerada uma significância de 5%. A análise estatística foi realizada usando o SigmaPlot, versão 12.0 para Windows, e os gráficos foram criados pelo GraphPad Prism, versão 5.0 para Windows. Resultados Parâmetros Morfológicos Os animais não apresentaram diferença em relação à massa corporal inicial nem à final. Aqueles submetidos a IM apresentaramáreamédia de infarto de 36%. Foi possível observar maior proporção de massa miocárdica, massa ventricular direita e esquerda/corpo em relação ao grupo placebo, indicando remodelação cardíaca em ambos os ventrículos. Em relação à congestão pulmonar e hepática, as taxas mais elevadas da primeira foram observadas apenas no grupo ICC (Tabela 1). Parâmetros Hemodinâmicos Foi observada menor pressão arterial média no grupo ICC em comparação ao grupo placebo. A PAS e a PAD, bem como a FC, não apresentaram diferença em relação ao grupo controle (Tabela 2). Em relação às variáveis de pressão ventricular, observou-se PSVE e PDFVE maior no grupo ICC, quando comparado ao grupo placebo (Tabela 2). Aderivadapositivamáximadapressãoventricular (+dP/dt máx ) apresentou alterações no grupo ICC, apresentando valores mais baixos, assim como a derivada negativa máxima da pressão ventricular (-dP/dt máx ), que apresentou valores mais baixos quando comparados ao grupo controle (Tabela 2). 236