ABC | Volume 115, Nº2, Agosto 2020

Artigo Original Basilio et al. Efeitos da dieta intermitente no coração Arq Bras Cardiol. 2020; 115(2):184-193 seguido por incrementos de 3 m/min, que perdurou por 3 minutos. O protocolo foi finalizado quando o animal atingisse a exaustão ou quando a coordenação entre as passadas se apresentasse dificultada. 21 Para avaliar a resposta de lactato, 25 µl de sangue foram coletadas da cauda do animal em repouso e após cada estágio de esforço. O sangue coletado foi imediatamente armazenado em tubo Eppendorf contendo 50 µl de fluoreto de sódio (NaF) a 1%. As amostras de sangue foram refrigeradas após a coleta e, em seguida, mantidas em freezer (-20 °C) até a análise, que foi realizada em analisador eletroquímico YSI 150 Sport ( Yellow Springs Instruments ®, Ohio, EUA) com erro-padrão da medida de ±2%. Os resultados foram dados em mmol/l e a determinação do limiar anaeróbico de lactato (LL) foi realizada por plotagem gráfica do comportamento das concentrações durante o teste. O LL foi determinado pelo momento de quebra da linearidade em função do aumento de carga, obtido mediante inspeção visual. A capacidade funcional foi avaliada pela velocidade no limiar de lactato (VLL), distância percorrida, concentração de lactato sanguíneo no limiar de lactato (LacLL) e no momento da exaustão (LacE), determinados durante o teste de esforço. Além disso, para melhor detalhar a cinética de lactato, considerou-se também a variação relativa (%) de níveis de lactato, obtida a partir das medidas de lactato LacLL e LacE. Caracterização Metabólica Para análise do metabolismo glicêmico, os animais foram submetidos a jejum por 8–12 horas e amostras sanguíneas provenientes da artéria caudal foram utilizadas para a dosagem de glicose na condição basal. A seguir, realizou- se administração intraperitoneal de glicose a 20% (Glicose Monohidratada, Merck, São Paulo, Brasil), em dosagem equivalente a 2 g/kg. Os níveis glicêmicos foram então avaliados após 15, 30, 60, 90, 120 e 180 minutos. 7,10 Para tanto, utilizou-se do glicosímetro ACCU-CHEK GO KIT (Roche Diagnostic Brazil Ltda, SP, Brasil). 23,24 Caracterização Nutricional A caracterização nutricional envolveu ingestão alimentar (IA), ingestão calórica (IC) e eficiência energética. A IA foi avaliada diariamente e a IC foi calculada pela seguinte fórmula: IA × (valor calórico da dieta). 23 A massa corporal foi mensurada semanalmente, utilizando-se uma balança digital. A variação ponderal foi obtida a partir da diferença entre os valores de massa corporal inicial e final, segundo momento de análise. Para analisar a capacidade de conversão da energia ingerida em massa corporal, considerou-se a eficiência alimentar (EA), obtida a partir da relação entre variação ponderal total (g) e energia total ingerida (kcal). 23,24 Após o período experimental os animais foram mantidos em jejum por um período de oito horas, submetidos a anestesia intraperitoneal com cloridrato de cetamina (50 mg/ kg/ip; Dopalen®, Sespo Indústria e Comércio Ltda – Divisão Vetbrands, Jacareí, São Paulo, Brasil) e cloridrato de xilazina (10 mg/kg/ip; Anasedan®, Sespo Indústria e Comércio Ltda – Divisão Vetbrands, Jacareí, São Paulo, Brasil). Após a eutanásia por decapitação, foram executadas toracotomia e laparotomia mediana para remoção do coração e retirada de tecido adiposo branco dos compartimentos retroperitoneal e epididimal. 24 Considerou-se a soma dos dois compartimentos em valores absolutos e relativos para a determinação da adiposidade corporal. Caracterização Morfológica do Coração Para avaliar a morfologia macroscópica do coração, foram mensuradas as massas de átrios (MA) e dos ventrículos direito (MVD) e esquerdo (MVE) em valores absolutos e em relação à massa corporal final (MCF) e o comprimento da tíbia. Posteriormente, foram retiradas amostras do ventrículo esquerdo a partir de incisão transversal a 6 mm do ápice. Os fragmentos foram imersos em solução tamponada de formol a 10%, na qual foram mantidos por 48 horas. Cada fragmento miocárdico foi então submetido a água corrente e mantidos sob solução de etanol a 70% por mais 48 horas. Após a etapa de fixação, os materiais foram compactados em blocos de parafina. Foram confeccionadas lâminas histológicas com secções teciduais de 4 a 7 μm de espessura, submetidas à coloração com hematoxilina-eosina (HE) e picro-sirius red (PSR). Para a análise morfométrica dos cardiomiócitos, foram consideradas medidas de área cardiomiocitária e fração intersticial de colágeno do miocárdio. 23-25 Para a tomada de medidas de áreas, foram consideradas lâminas coradas em HE; para cada animal, foram amostrados pelo menos 100 cardiomiócitos. As lâminas coradas por PSR foram utilizadas somente para a quantificação do conteúdo de colágeno do meio intersticial miocárdico. Fixado o campo de imagem, os componentes do tecido cardíaco foram identificados segundo a cor realçada. Os filamentos de colágeno refletiram a cor vermelha enquanto os cardiomiócitos revelaram a coloração amarela. A fração intersticial de colágeno correspondeu à medida relativa (%) do conteúdo de colágeno sobre toda a extensão tecidual. Um mínimo de 20 campos foi utilizado e regiões perivasculares foram desconsideradas. Como instrumental analítico, os cortes histológicos foram projetados em aumento de 40X com o auxílio de microscópio (LEICA DM LS) acoplado a uma câmera de vídeo que projeta imagens digitais em um microcomputador IBM equipado com programa analisador de imagens Image Pro-plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, EUA). Análise da Expressão de MAPK Os níveis de expressão proteica de MAPK foram determinados por meio de procedimentos de Western blot, utilizando-se anticorpos primários específicos (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, EUA): p-JNK (sc-6254), total JNK1/2 (sc-137019), p-ERK1/2 (sc-16982), total ERK 1 (sc-93). Os níveis de proteína obtidos foram normalizados pela expressão de GAPDH (6C5, sc-32233). Os métodos de preparação tecidual e condições de eletroforese são detalhados em estudos previamente publicados. 24,26 186