ABC | Volume 112, Nº5, Maio 2019

Artigo Original Effting et al Efeitos do ER: coração e obesidade Arq Bras Cardiol. 2019; 112(5):545-552 Eutanásia Após 24h do último teste de tolerância à insulina foi realizada a eutanásia por decapitação e o ventrículo esquerdo do coração foi cirurgicamente extraído, imediatamente congelado em nitrogênio líquido, e armazenado à –80ºC para análises bioquímica. Análises bioquímicas Para os ensaios bioquímicos descritos a seguir e teste de ELISA, todas as amostras foram homogeneizadas em tampão PBS (fosfato-salino) 50 mM, com adição de 10 uM de aprotinina. O homogeneizado foi centrifugado por 10min a 4ºC e o sobrenadante foi estocado à –80ºC. Os níveis de proteína foram determinados em todas as amostras utilizando o método Bradford. 15 Oxidação de diclorodiidrofluorescína (DCFH) Os níveis de espécies reativas foram mensurados com base na oxidação da sonda 2’,7’- diclorodiidrofluorescína diacetato (DCFH-DA) em um composto fluorescente 2’,7’- diclorodiidrofluoresceína (DCF), como previamente descrito. 16 Uma alíquota do lisado foi incubada comDCFH-DA 80 mM a 37°C durante 15 minutos. A produção de espécies reativas foi quantificada utilizando uma curva padrão de DCF e os dados foram expressos como nM DCF/mg de proteína. Atividade de enzimas antioxidantes A atividade da superóxido dismutase (SOD) foi estimada através da inibição da auto oxidação da adrenalina e lida espectofotometricamente a 480 nm de acordo com o método descrito por McCord e Fridovich. 17 A atividade da catalase (CAT) foi determinada com base na taxa de decomposição de Peróxido de Hidrogênio (H 2 O 2 ) gerada pela enzima presente na amostra usando uma solução H 2 O 2 em 10mM em tampão fosfato de potássio, pH 7,0. A taxa máxima de decomposição H 2 O 2 foi medida em 240 nm. 18 Os valores foram expressos como unidades de SOD ou CAT por mg de proteína. Níveis de glutationa total (GSH) Os níveis de GSH foram pelo método de Hissin. 19 As amostras foram incubadas em 0,6% de ácido sulfosalicílico seguido por uma reação de GSHpresente na amostra com ácido 2-nitrobenzóico (5,5'-Dithiobis) (DTNB) produzindo um aducto de glutationa-TNB oxidado (GS-TNB). A cor resultante a partir da reação entre o DTNB e tióis contra a curva padrão de GSH foi determinado cineticamente a 412 nm depois por 10 min. Valores expressos em nmol/min/mg de proteína. Lipoperoxidação As concentrações de malondialdeído (MDA) nas amostras foram determinadas por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Agilent Technologies 1200 Series; Santa Clara, CA, EUA) de acordo com Grotto et al., 20 utilizando uma derivação de ácido tiobarbitúrico (TBA). Uma curva padrão foi preparada utilizando sal de tetrabutilamônio de MDA em concentrações que variam de 0,5 a 5 µmol/L. O MDA foi determinado à 532 nm e os resultados foram expressos em umol/L de MDA/miligrama de proteína. Parâmetro inflamatório A concentração do fator de necrose tumoral alfa (TNF- α ) foi avaliado por ensaio de imuno absorção enzimática (ELISA) de acordo com as recomendações do fabricante (ThermoFisher Scientific, cat.KMC3011). Resultados expressos em pg/mg de proteína. Análise estatística Inicialmente, os dados foram confrontados pelo teste de Grubbs para verificação de possíveis outliers seguido pelo teste de normalidade Shapiro-Wilk, sendo que os mesmos atenderam às pressuposições para o uso de testes paramétricos. Foi então realizado o teste variância de duas vias ( two-way ANOVA) seguido pelo teste post-hoc Bonferroni quando necessário. Para análise dos dados do TTI (Tabela 2) foi realizado o teste de variância de uma via ( one-way ANOVA) de medida repetida seguido pelo post-hoc teste de Tukey quando necessário. O nível de significância adotado foi de p < 0,05. Foi utilizado o Graph Pad Prism versão 5 como pacote estatístico. Todos os dados foram expressos emmédia e desvio padrão, exceto pela figura 1A, expressa em média e erro padrão da média. Resultados Peso corporal e resistência à insulina OER teveumefeitobenéfico impedindoqueo grupoDIO+ER continuasse ganhando peso mesmo frente ao consumo da DIO, não caracterizando emagrecimento, mas sim uma manutenção do peso mesmo sem controle de ingesta (Figura 1A-C). O TTI realizado pré-exercício demonstrou que os animais expostos à DIO apresentam um quadro de resistência à insulina (p > 0,05) (Tabela 2). Os resultados demonstraram que a DIO pode levar a um prejuízo da captação da glicose mesmo frente à um estímulo externo de insulina (2U/kg de peso). O ER (p < 0,05), mesmo frente ao consumo de DIO, foi capaz de retardar a progressão do quadro, mantendo melhor taxa de decaimento da glicose quando comparada ao grupo DIO sedentário (p < 0,01). Não houve diferença significativa entre pré e pós exercício em nenhum grupo (Figura 1D). Oxidação do DCFH Os níveis de oxidação de DCFH foram mensurados como indicadores da produção de espécies reativas, especialmente peróxido de hidrogênio, e os resultados demonstraram que em animais não treinados, a DIO causou aumento dos níveis de DCF (p < 0,001) em comparação aos animais com DP. Por sua vez, nos animais alimentados com DIO e submetidos ao treinamento resistido (DIO+ER), foi observado uma diminuição significativa dos níveis de DCF em comparação com o grupo DIO (p < 0,01) (Figura 2A). 547