ABC | Volume 112, Nº4, Abril 2019

Artigo Original Vassalo et al Mercúrio aumenta a atividade da ECA e o estresse oxidativo Arq Bras Cardiol. 2019; 112(4):374-380 Tabela 1 – Peso corporal (PC), Cérebro/PC, Coração/PC, Rim/PC, Pulmão/PC, Adrenais/PC, Baço/PC e Fígado/PC de ratos Wistar tratados com HgCl 2 e ratos não tratados e ratos espontaneamente hipertensos (SHRs: spontaneously hypertensive rats ) Wistar controles n = 6 Wistar tratados com HgCl 2 n = 8 SHRs controles n = 9 SHR tratados com HgCl 2 n = 9 Peso corporal (PC) (g) 399 ± 58,3 384 ± 18,1 216 ± 20,1* † 222 ± 14,4* † Cérebro/PC (mg/g) 4,58 ± 0,7 4,69 ± 0,5 7,48 ± 0,7* † 7,41 ± 0,5* † Coração/PC (mg/g) 3,06 ± 0,6 3,43 ± 0,2 3,77 ± 0,2 3,81± 0,2 Rim/PC (mg/g) 6,44 ± 1,7 6,53 ± 0,5 6,78 ± 0,3 6,80 ± 0,6 Pulmão/PC (mg/g) 3,97 ± 1,5 4,53 ± 0,6 6,48 ± 1,2* † 7,91 ± 1,2* † Resultados representam média ± DP; n: número de animais usados. One-way ANOVA, teste post hoc de Tukey. *p < 0,05 em comparação a Wistar controles e †  p < 0,05 em comparação a ratos Wistar tratados com HgCl 2 . computacional e interface para coleta de dados (MP100A, Biopac System, Inc., Santa Barbara, CA, EUA). A frequência cardíaca (FC) foi determinada nos intervalos entre batimentos. Medida da produção de malondialdeído (MDA) Os níveis de MDA no plasma, coração, aorta, rim e pulmões foram medidos utilizando-se o teste de ácido tiobarbitúrico (TBA) modificado. 28 Amostras do plasma de tecidos foram misturadas com ácido tricloroacético 20% em HCl 0.6 M (1:1, v/v); os tubos foram mantidos em gelo por 20 minutos para precipitar componentes do plasma e evitar possíveis interferências. As amostras foram centrifugadas a 1500 x g por 15 minutos antes de se adicionar TBA (120 mM em Tris 260 mM, pH 7) ao sobrenadante em uma proporção de 1:5 (v/v); em seguida, a mistura foi aquecida a 97 o C por 30 minutos. Foram obtidas medidas por espectrofotometria a 535 nm a 20 o C. Teste da atividade da ECA A atividade da ECA foi medida no plasma, coração, artéria aorta, cérebrp, rim, e pulmões pelo método fluorométrico adaptado de Friedland e Silverstein. 29 Em resumo, amostras de tecido e de plasma em triplicata foram incubadas por 15‑90 minutos a 37 o C com 40 μL de tampão do ensaio contendo o substrato da ECA 5 mM Hip-His-Leu (Sigma). A reação foi interrompida pela adição de 190 μL de 0,35MHCl. O produto gerado, His-Leu, foi medido por fluorometria após 10 minutos de incubação com 100 μL de o-ftalaldeído 2% em metanol. As medidas de fluorescência foram obtidas a 37% em um leitor de placa FLUOstar Optima (BMG Labtech, Ofembugo, Alemanha), com excitação de 350 nm e filtros de emissão 520 nm. O leitor de placa de fluorescência foi controlado utilizando-se o programa FLUOstar Optima. Microplacas de poliestireno de 96 poços (Biogen Cientifica, Madri, Espanha) foram usadas. Uma curva de calibração com ECA de pulmão de coelho (Sigma) foi incluída em cada placa. Análise estatística Os resultados foram expressos em média ± DP. Todos os parâmetros foram testados quanto à normalidade usando o teste de Kolmogorov-Smirnov para uma amostra. As diferenças foram analisadas pelo teste ANOVA de um fator (one-way ANOVA), seguido do teste post-hoc de Tukey (GraphPad Prism Software, San Diego, CA). Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo. Resultados No trigésimo dia de tratamento com mercúrio, os ratos Wistar controle, ratos Wistar tratados, SHRs tratados e não tratados apresentavam peso corporal similares, apesar de os SHRs apresentarem menor peso em comparação aos ratos Wistar (Tabela 1). A Tabela 1 também mostra que o peso de vários órgãos, normalizado pelo peso corporal, foi similar, incluindo cérebro, coração, rim e pulmões, fato que não mudou após o tratamento com mercúrio. PAS indireta no dia zero em ratos acordados mostrou que SHRs apresentaram maior pressão arterial média em comparação a ratos Wistar (Tabela 2). No entanto, ao final do tratamento, o mercúrio produziu aumento significativo da pressão arterial nos SHRs tratados com HgCl 2 (Tabela 2). Valores de pressão arterial, pressão ventricular e seus respectivos derivados, bem como as medidas de FC nos ratos anestesiados não foram diferentes entre os grupos (Tabela 3). Porém, a PDFVE aumentou após o tratamento com mercúrio no grupo Wistar, em concordância com o descrito anteriormente. 17 Estudos prévios com animais e humanos relataram que o mercúrio aumenta a síntese de radicais livres, levando ao estresse oxidativo. 4,24,30,31 Em seguida, avaliamos o estado oxidante no sangue e em vários outros tecidos pela medida dos níveis de MDA (Tabela 4). Níveis plasmáticos de MDA foram maiores nos ratosWistar tratados commercúrio emcomparação àqueles não tratados, mas não houve diferença entre SHRs tratados e não tratados com mercúrio. Mercúrio aumentou os níveis de MDA no coração de ratos Wistar e SHRs. Na aorta, diferentemente do plasma, os níveis de MDA foram maiores nos SHRs tratados com mercúrio, mas não nos ratos Wistar. Em relação a cérebro e pulmões, nenhuma diferença foi observada nos níveis de MDA nos ratos Wistar tratados e não tratados commercúrio; nos SHRs, contudo, a intervenção com mercúrio reduziu os níveis de MDA nesses órgãos. Nos rins, o tratamento com mercúrio reduziu os níveis de MDA nos ratos tratados com mercúrio, Wistar e SHRs. 376