IJCS | Volume 31, Nº2, Março / Abril 2018

116 complementada com a linhaça moída. Após a mistura ter sido triturada, foi transformada em pelotas, que foram aquecidas em um forno elétrico por 10 minutos a uma temperatura de 180°C. Opreparado alimentar foi armazenado sob refrigeração até o uso. Preparação dos animais e coleta da amostra Os animais foramanestesiados e sangue foi coletado de acordocomométododescritoporPrécomaet al. 9 eAlessi et al. 10 Xilazina (Coopazine  ; Schering‑Plough‑Coopers, Cotia, SP, Brasil) a 5 mg/kg misturada com cetamina (Vetanarcol  , König, Mairinque, SP, Brasil) a 30 mg/kg foi administrada por via intramuscular na região da coxa dos coelhos. Análises bioquímicas realizadas nos dias 1 e 84 incluíram colesterol total (CT), LDL-C, lipoproteína de alta densidade (HDL-C) e triglicérides (TG), que foram avaliados comequipamento automatizado (ADVIA 1200, Siemens Healthcare Diagnostics, Inc., Newark, EUA) e  kits comerciais. Análise histológica A aorta torácica foi removida ao nível da bifurcação aortoilíaca após toracotomia e laparotomia mediana. Seções transversais com 2 a 3 mm de espessura foram cortadas a partir de diferentes segmentos aórticos. Cada segmento foi identificado, montado em um micrótomo (Leica ® RM2145, LeicaMicrosystemsNussloch GmbH, Alemanha) para processamento durante a noite e desidratado com etanol em concentrações seriadas (70%, 80% e 90%). As amostras de tecido foram posteriormente diafanizadas por 12 horas emxilol contendo concentrações seriadas de parafina. Blocos de parafina foram obtidos através da incorporação das amostras emparafina quente com utilização de um inclusor (Leica ® EG1160, Leica Microsystems Nussloch GmbH, Alemanha), de acordo com o procedimento padrão. Os blocos de parafina foram cortados em seções de 5 μm com utilização do micrótomo (Leica ® RM 2145). Cada seção foi corada com hematoxilina e eosina (HE) e orceína (coloração para tecido elástico) de acordo com técnicas convencionais emontada emlâminaspermanentes. Blocos com quatro segmentos de aorta foram preparados por meio de seleção de um segmento proximal perto do arco aórtico (ponto 1), um segmento localizado na aorta torácica (ponto 2), um segmento proximal na aorta abdominal (ponto 3) e um segmento distal da aorta abdominal (ponto 4). Estes segmentos foram selecionados de acordo com os achados histológicos na coloração com HE. Análise imunohistoquímica A técnica de arranjo em matriz de amostras teciduais ( tissue microarray ; TMA) foi utilizada para a análise imunohistoquímica. As amostras foram incubadas com anticorpos monoclonais contra a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) a uma diluição de 1:50 e misturadas com anticorpo monoclonal contra o fator de necrose tumoral alfa (TNF- α ) por 1 hora. Os anticorpos foram detectados por incubação das lâminas com o substrato 3,3-diaminobenzidina (DAB; DakoCytomation A/S, Glostrup, Dinamarca). Contracoloração foi realizada comhematoxilina deMayer, seguida por desidratação da amostra com diferentes concentrações de etanol a 100% e desparafinizadas com xilol. As lâminas foram montadas com bálsamo do Canadá. O protocolo descrito acima foi padronizado emnosso departamento. Controles positivos e negativos foram utilizados para cada reação. Os cortes histológicos foram digitalizados com um scanner (Axio Scan Z1, Zeiss, Jena, Alemanha) e as imagens foram analisadas com o programa Image-Pro Plus ® , versão 4.5. O método de morfometria de cores foi aplicado, colorindo em rosa as áreas com imagens positivas de anticorpos e em marrom aquelas com imagens negativas. Os dados foram transferidos para uma planilha do Excel e submetidos à análise estatística. Análise estatística Os resultados estão expressos como média, mediana, valor mínimo e máximo e desvio padrão. A suposição de normalidade das variáveis foi avaliada através do teste de Kolmogorov-Smirnov. As variáveis que não satisfizeram a suposição de normalidade foram analisadas com o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Os valores de p abaixo de 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Os dados foramanalisados como programa estatístico IBM SPSS, versão 20.0. Resultados Ocorreu um óbito no grupo G3 na semana experimental 12, resultando em um total de 29 coelhos na amostra final do estudo. Martins et al. Semente de linhaça reduzTNF-α Int J Cardiovasc Sci. 2018;31(2)114-122 Artigo Original