ABC | Volume 114, Nº6, Junho 2020

Artigo Original Yurre et al. Avaliação dos efeitos cardíacos de WSMoL Arq Bras Cardiol. 2020; 114(6):1029-1037 na presença de ADP, dividido pelo fluxo após a oligomicina. A capacidade fosforilativa máxima do sistema de transporte de elétrons (OXPHOS) foi calculado pelo consumo de oxigênio após a adição do succinato menos o consumo de oxigênio residual (ROX), o qual foi estimado após a adição da antimicina A. O vazamento inespecífico de prótons foi determinado pelo fluxo de oxigênio não sensível à oligomicina menos o ROX. Um protocolo distinto foi realizado, alterando a sequência dos substratos, para calcular o vazamento de elétrons, a relação de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) pelo fluxo de O 2 . A ordem de titulação deste protocolo foi a seguinte: 5mMpiruvato, 2.5mM malato, 10 mM glutamato, 10 mM succinato, 1 mM ADP e 0,2 μg/mL oligomicina. Os dados foram analisados em software DatLab 5 (Oroboros Instruments) e expressos empmol O 2 /mg/s. Produção mitocondrial de H 2 O 2 O H 2 O 2 mitocondrial foi medido monitorizando-se a taxa de aparecimento de resorufina a 563/587 nm (excitação/ emissão) em um espectrofotômetro de fluorescência (Varian Cary Eclipse, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Amesma concentração demitocôndria isolada que foi utilizada nos experimentos de consumo de oxigênio foi acrescentada em 2 mL de MIR05 suplementado com 5,5 μM Amplex red, 2 U/mL peroxidase e 40 U/mL superóxido dismutase. Os ensaios de produção de H 2 O 2 foram realizados a 37 ºC, e os substratos, inibidores e desacopladores foram acrescentados na ordem seguinte: 5 mM piruvato, 2,5 mM malato, 10 mM glutamato, 10 mM succinato, 1 mM ADP, 0,2 μg/mL oligomicina, 2 títulos de 0,5 μM de cianeto de carbonila-4- (trifluorometoxi) fenil-hidrazona (FCCP) e 2 μM antimicina A. Os dados gerados em unidades arbitrárias de fluorescência foram analisados no software Origin Pro-8 (Origin Lab Corporation, Northampton, MA, EUA) e normalizados em pmol de H 2 O 2 /mg/min a partir da calibração padrão das curvas de H 2 O 2 realizadas na presença do mesmo número de mitocôndrias isoladas para cada experimento. Análise estatística Os valores são expressos como média ± desvio padrão ou mediana (com intervalo interquartil). Para comparar os resultados entre os grupos CNTRL e WSMoL, foi utilizado o teste t de Student não pareado, quando apropriado. De outra maneira, os dados que apresentaram distribuição não gaussiana (teste Kolmogorov-Smirnov) foram comparados pelo teste Mann-Whitney. Foram consideradas significativas as diferenças entre as variáveis quando o valor p era < 0,05. Todas as análises foram realizadas utilizando GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). Nós não utilizamos métodos estatísticos para predeterminar o tamanho das amostras. Os tamanhos das amostras foram estimados com base na disponibilidade da amostra e em estudos experimentais anteriores do sistema cardiovascular. 29,30 Resultados O tratamento de 21 dias com WSMoL não induziu alterações (p > 0,05) nos níveis de glicose no sangue (Figura 1A) nem no peso corporal (Figura 1B), em comparação com o grupo CNTRL. Além disso as relações PC/PCorp (Figura 1C) e PC/CT (Figura 1D) foram semelhantes (p > 0,05) em ambos os grupos, indicando que nenhuma hipertrofia cardíaca foi desenvolvida. O tratamento também não modificou a tolerância à glicose (Figura 1E) ou a resistência à insulina (Figura 1F), em comparação com os camundongos não tratados (p > 0,05), revelando a ausência de alterações no metabolismo de carboidratos. A Figura 2 mostra os parâmetros de ECG no 21º dia de tratamento. Os intervalos PR, RR, QRS e QJ (Figura 2C–F) não foram significativamente diferentes (p > 0,05) entre os grupos WSMoL e CNTRL. A DPA 30 e a DPA 90 foram semelhantes (p > 0,05) entre os camundongos tratados e não tratados (Figura 2G–J). Portanto, os dados obtidos aqui consistentemente demonstraram que o tratamento com WSMoL foi seguro para o comportamento elétrico de corações de camundongo. Considerando que tem sido demonstrado que alguns antibióticos podem prejudicar a função e a estrutura do ventrículo esquerdo, nós estudamos a função do ventrículo esquerdo detalhadamente utilizando ECHO (Figura 3). Os camundongos dos grupos CNTRL e WSMoL apresentaram estrutura e função ventricular esquerda preservada, conforme indicada pela ausência de diferenças significativas (p>0,05) nos parâmetros seguintes: fração de ejeção (Figura 3A), alteração da área fracionária (Figura 3B), volume sistólico (Figura 3C), volume diastólico final (Figura 3D), volume sistólico final (Figura 3E) e massa ventricular esquerda (Figura 3F). Como um conjunto, esses dados demonstram que o tratamento com WSMoL não prejudicou a função ventricular esquerda. Finalmente, para verificar se WSMoL interfere na fisiologia da função mitocondrial cardíaca, nós empregamos abordagens experimentais para analisar duas funções mitocondriais importantes: fosforilação oxidativa e produção de espécies reativas de oxigênio. O tratamento de 21 dias com WSMoL não induziu alterações no consumo de oxigênio mitocondrial, conforme demonstrado na Figura 4A–E. Além disso, o tratamento não interferiu com a taxa de produção de H 2 O 2 na presença de diversos substratos, inibidores e desacopladores (Figura 4F), e não alterou o vazamento de elétrons (Figura 4G) em comparação com o grupo CNTRL. Discussão A alta toxicidade de algumas drogas atualmente utilizadas para o tratamento várias doenças é uma grande preocupação em sistemas de saúde. Por exemplo, diversas classes de antibióticos são cardiotóxicas. 18-20 Neste cenário, compostos naturais têm sido cada vez mais estudados devido ao seu potencial na descoberta e no desenvolvimento de medicamentos. 36 Porém é importante também avaliar a segurança de compostos naturais utilizados para fins alimentares e médicos. Estudos anteriores realizados pelo nosso grupo demonstraram as atividades antibacterianas e imunomoduladoras da WSMoL, 8-10 que tambémé uma proteína coagulante das sementes de M. oleifera . Neste estudo, nós avaliamos os potenciais efeitos cardiotóxicos daWSMoL, quando administrada por via oral emcamundongos. Estudos de segurança são imperativos, mesmo quando as lectinas são administradas por via oral, visto que tem sido relatado que algumas proteínas desta classe podem atravessar a barreira intestinal e ser encontradas sistemicamente. 37 1032