ABC | Volume 114, Nº6, Junho 2020

Artigo Original Yurre et al. Avaliação dos efeitos cardíacos de WSMoL Arq Bras Cardiol. 2020; 114(6):1029-1037 Glicemia de jejum, teste de tolerância à glicose intraperitoneal e teste de tolerância à insulina intraperitoneal As concentrações de glicemia de jejum foram determinadas a partir do sangue das veias da cauda usando um glicosímetro automatizado (Contour TM TS Bayer), teste de tolerância à glicose intraperitoneal (TTGI) e o teste de tolerância à insulina intraperitoneal (TTII), os camundongos foram mantidos em jejum por 6 h e 4 h, respectivamente. Após o período de jejum, os animais receberam, por via intraperitoneal, 2 g/kg de glicose para o TTGI ou 0,5 IU/kg de insulina TTII, 28 e níveis de glicemia de jejum foram monitorizados 0, 15, 30, 60, 120 min após injeção de um corte na cauda. Foi calculada a área sob a curva (AUC) utilizando todos os pontos no tempo, descontando os valores basais de glicose para cada animal. Eletrocardiografia e ecocardiografia Para avaliar a atividade elétrica cardíaca in vivo , foi realizado um registro de eletrocardiograma (ECG) nos animais conscientes utilizando um método não invasivo, 29 a saber: dois eletrodos subcutâneos implantados sob anestesia com isoflurano nas patas dianteiras direita e esquerda, correspondendo à derivação I do ECG. No momento do registro, os eletrodos foram conectados por cabos flexíveis a um amplificador diferencial caseiro acoplado em CC (generosamente fornecido por Dr. Ariel Escobar, University of California, Merced, EUA), utilizando um filtro passa-baixo de 500 Hz e uma frequência de aquisição de 1 kHz. O sinal foi digitalizado usando Digidata 1440A (Axon Instruments, San José, CA, EUA) e registrado usando um programa de aquisição baseado em Labview (National Instruments, Austin, TX, EUA). Foram analisadas as durações dos seguintes intervalos: PR, RR, QRS e QJ. A função cardíaca foi avaliada por ecocardiografia (ECHO) in vivo utilizando o Sistema de Imagem de Alta Resolução Vevo 770 (VisualSonics, Toronto, Canadá) acoplado a um transdutor de 30 MHz, sob anestesia com isoflurano. As imagens foram adquiridas na modalidade bidimensional e analisadas por um investigador cego. Foram calculados o volume diastólico final, o volume sistólico final, a fração de ejeção e a mudança de área fracionada do ventrículo esquerdo utilizando o método de Simpson. Resumidamente, estes parâmetros de função cardíaca foram avaliados em um corte do eixo paraesternal longitudinal e em quatro imagens do eixo curto no modo B em alta resolução temporal, obtidas em diferentes níveis ventriculares, como descrito anteriormente. 30 Potencial de ação Para realizar registros do potencial de ação (PA) cardíaco em coração intato, umsistema de perfusão retrógrada de Langendorff foi utilizado para manter os corações funcionais ex vivo durantes horas, como previamente descrito. 31,32 Para evitar danos no tecido cardiaco pela formação de coágulos sanguíneos, os animais foram injetados por via intraperitoneal, com Na + -heparina, 15 min antes da eutanásia que foi realizada por deslocamento cervical. Os corações foram rapidamente removidos, canulados pela aorta e continuamente perfundidos com uma solução de Tyrode oxigenada contendo o seguinte (emmM): NaCl 140, KCl 5,3, CaCl 2 2, MgCl 2 1, NaPO4H2 0,33, HEPES 10 e glicose 10. O pH foi calibrado para 7,4 com NaOH a 32 ºC. Para diminuir a contração mecânica, os corações foram perfundidos com Tyrode contendo 4 mM de Blebbistatin (Selleckchem, Houston, TX, EUA). Foram usados microeletrodos de vidro borossilicato (10‑40MΩ) para registrar os sinais elétricos. Estes microeletrodos foram preenchidos com solução de KCl 3 M e inseridos em um suporte (MEH1SF12, World Precision Instrument [WPI], Sarasota, FL, EUA) incorporado em um micromanipulador (MM33 links, WPI) conectado à entrada de umpré‑amplificador (Electro 705, WPI). Os microeletrodos foram colocados na superfície do ventrículo esquerdo e a leitura do microeletrodo foi ajustada em zero. Os sinais amplificados foram digitalizados (NI USB 6281, National Instrument) e analisados com um programa caseiro em LabView (generosamente desenvolvido e fornecido por Dr. Ariel Escobar, University of California, Merced, CA, EUA). Os parâmetros analisados foram a duração do potencial de ação (DPA) a 30% e 90% de repolarização (DPA 30 e DPA 90 , respectivamente). Isolamento das mitocôndrias cardíacas dos camundongos O isolamento das mitocôndrias cardíacas dos camundongos foi adaptada do protocolo descrito por Affourtit et al., 33 com pequenas modificações. Os corações foram rapidamente dissecados e lavados em tampão Chappell-Perry (CP) gelado, contendo o seguinte (em mM): KCl 100, Tris-HCl 50, EGTA 2 com pH de 7,2. Os corações foram pesados, picados com lâminas e lavados 4 a 5 vezes com tampão CP. O tecido foi subsequentemente incubado por 5 min com tampão CP suplementado com albumina a 0,5%, 5 mM de MgCl2, 1 mM de ATP e 125 U/100 mL de protease tipo VIII, na proporção de 1 mL/100 mg de tecido. Após isso, os corações foram homogeneizados (Ultra-turrax homogenizer [IKA®, Campinas, SP, Brasil], configuração baixa, 3 s, 3 vezes), e o homogenato resultante foi centrifugado. O sobrenadante foi centrifugado e o sedimento foi lavado e ressuspenso em tampão CP gelado e finalmente centrifugado. O sedimento mitocondrial final foi ressuspenso emum volume pequeno de tampão CP. A dosagem de proteína da preparação obtida foi realizada pelo método descrito por Lowry et al. 34 . As preparações mitocondriais isoladas foram submetidas à respirometria de alta resolução para medir os fluxos de consumo de oxigênio. Respirometria de alta resolução Para as análises de consumo de oxigênio, foram usadas mitocôndrias isoladas. Os experimentos foram realizados em um respirômetro O2k de alta resolução (Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria, UE) a 37°C com meio de respiração mitocondrial (MIR05) contendo o seguinte (in mM): EGTA 0.5, MgCl 2 3, K-MES 60, taurina 20, KH 2 PO 4 20, HEPES 20, sacarose 110 e 1 g/L BSA livre de gordura com pH de 7,1. O protocolo utilizado para avaliar a função mitocondrial foi adaptado de Pesta e Gnaiger, 35 consistindo na adição sequencial de múltiplos substratos e inibidores, a saber: 5mMpiruvato, 2,5mMmalato, 10 mM glutamato, 100 μM 5’-difosfato de adenosina (ADP), 1 mM ADP, 10 mM succinato, 0,2 μg/mL oligomicina e 2 μM antimicina A. A relação de controle respiratório (RCR) foi calculada pelo fluxo de oxigênio após a adição do succinato 1031