ABC | Volume 114, Nº1, Janeiro 2020

Artigo Original Alegre et al. Açaí e isquemia-reperfusão miocárdica em ratos Arq Bras Cardiol. 2020; 114(1):78-86 os corações foram submetidos a um período de 30 minutos de isquemia global, seguido de 30 minutos de reperfusão. 3 A isquemia global foi induzida pela interrupção completa do fluxo da solução de Krebs-Henseleit para o coração. Após os períodos de isquemia e reperfusão, foi realizada uma avaliação da função ventricular esquerda. O volume dentro do balão foi aumentado progressivamente para obter variação da pressão diastólica do ventrículo esquerdo de 0 a 25 mmHg. Além disso, para cada aumento de volume no balão, foram registradas as pressões diastólica e sistólica, a taxa máxima de desenvolvimento da pressão ventricular esquerda (+dP/dt) e a taxa máxima de diminuição da pressão ventricular esquerda (-dP/dt). Curvas de pressão‑volume diastólica foram construídas. Análise da área miocárdica infartada Foi realizado um corte transversal do ventrículo esquerdo (VE) – 5 mm do ápice, com espessura de 2 mm – e incubado em tampão de fosfato a 7,4 pH e cloreto de trifeniltetrazólio a 1% (Sigma Aldrich) por 30 minutos a 37°C. Depois disso, as seções foram incubadas em uma solução de formaldeído a 10% durante a noite. As seções ventriculares foram posicionadas entre duas lâminas de vidro e digitalizadas para obtenção das imagens. A área de infarto foi medida através do programa ImageJ por planimetria e expressa como a porcentagem de infarto em relação à área total. Nas células vivas, o corante é reduzido pelas desidrogenases e aparece com uma coloração vermelha escura. As células mortas sem as enzimas não são coradas e permanecem pálidas. 19 Análise de enzimas antioxidantes e hidroperóxido lipídico Amostras de aproximadamente 100 mg de tecido do VE foram homogeneizadas em um tampão de fosfato de sódio (0,01 M) com um pH de 7,4 e centrifugadas por 30 minutos a -4°C; as proteínas totais nas amostras foram quantificadas pelo método de Bradford. As atividades de glutationa peroxidase (GSH-Px), superóxido dismutase (SOD) e catalase no tecido cardíaco foram determinadas por espectrofotometria, de acordo com os métodos descritos anteriormente. 20,21 A concentração de hidroperóxido lipídico no tecido cardíaco foi medida pela oxidação do sulfato ferroso amoniacal e determinada por espectrofotometria. 22 Avaliação do metabolismo energético Amostras de aproximadamente 100 mg de tecido do VE foram homogeneizadas em tampão de fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0) e centrifugadas. O sobrenadante foi utilizado para determinar a concentração proteica e a atividade das enzimas β -hidroxiacil coenzima A desidrogenase, fosfofructoquinase, lactato desidrogenase, piruvato desidrogenase e citrato sintase. 23 O sedimento foi ressuspenso com tampão de fosfato de sódio (0,1M) contendo sacarose 250mMe EDTA 2mM, e foi utilizado para determinar a atividade de complexos enzimáticos da cadeia de transporte de elétrons (complexos I, II e ATP sintase). 24 As leituras foram realizadas em um leitor de microplacas com o software controlGen5 2.0, e todos os reagentes foram obtidos no laboratório Sigma-Aldrich (Saint Louis, EUA). Western blot As amostras de VE (80 mg) foram homogeneizadas com 1 ml de tampão de extração do ensaio de precipitação por radioimunidade (RIPA), centrifugadas e o sobrenadante foi coletado. A proteína nas amostras foi quantificada pelo método de Bradford e as amostras foram usadas para determinar a expressão proteica do fator nuclear κ B (NF‑ κ B) total e fosforilado, sirtuina 1 (SIRT1) e proteína forkhead box O1 (FOXO1). Para determinar o fator nuclear eritroid 2 (Nrf-2), as amostras de VE foram extraídas com o tampão de extração nuclear. 25 Todas as amostras foram diluídas em tampão Laemmli. A eletroforese de proteínas foi realizada a 4°C em gel de poliacrilamida de 8 a 10% ( Mini-Protean 3 Electroforesis Cell System , Bio-Rad, Hercules, EUA). Após eletroforese, os géis foram transferidos para as membranas de nitrocelulose (sistema Mini Trans-Blot , Bio-Rad, Hercules, EUA) em um sistema de transferência úmida seguido de bloqueio com solução de leite em pó desnatado a 5%. A membrana foi lavada e os anticorpos primários foram adicionados (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Europa). Após incubação durante a noite, a membrana foi lavada com solução basal e foram adicionados anticorpos secundários (Santa Cruz Biotechnology , Inc., Europa). Após 2 horas, a membrana foi lavada novamente em solução basal. A imunodetecção foi realizada com o método de quimioluminescência usando o Kit SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kit ( ThermoScientific , EUA). O fotodocumentador ImageQuant LAS 4000 ( General Eletrikcs ) foi utilizado para gerar imagens, que foram analisadas pelo programa Gel-Pro 32 ( Media Cybernetics , Rockville, EUA). Os resultados obtidos para as proteínas alvo foram normalizados pela expressão de gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAPDH), e o mesmo animal controle foi incluído em todas as eletroforeses para padronização entre os experimentos. Análise estatística Os valores obtidos são apresentados como média ± desvio padrão (variáveis com distribuição normal) ou mediana e quartil 25 e 75% (variáveis com distribuição não-normal). A normalidade foi verificada pelo teste de Kolmogorov– Smirnov. As comparações entre os grupos foram realizadas por teste t de Student não pareado (variáveis com distribuição normal) ou de Mann-Whitney (variáveis com distribuição não-normal). A análise estatística foi realizada pelo software SigmaStat, considerando nível de significância de 5% para todas as análises. Resultados Características gerais O peso corporal inicial e final dos animais não diferiu entre os grupos. Além disso, os ventrículos esquerdo e direito, o peso de fígado e o pulmão foram semelhantes entre os grupos. A ingestão diária de ração foi de aproximadamente 26 g para os dois grupos (Tabela 1). 80