ABC | Volume 113, Nº6, Dezembro 2019

Artigo Original Barbosa et al Nrf2, NF- κ B e PPAR β / δ em pacientes com DAC Arq Bras Cardiol. 2019; 113(6):1121-1127 Procedimentos analíticos e processamento de amostras Coletou-se sangue de cada participante pela manhã, após 12 horas de jejum noturno, sendo acondicionado em tubo com anticoagulante EDTA (1,0 mg/mL). O plasma foi centrifugado e separado (15 min, 3000xg, 4°C) e armazenado a –80°C até a análise. Foram coletadas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), diluindo-se as amostras de sangue com EDTA em PBS e as células foram separadas em 5 mL de Histopaque (Sigma-Aldrich) por centrifugação a 1800 g por 30 minutos. As PBMCs foram coletadas e lavadas duas vezes com PBS frio e ressuspensas e armazenadas (−80°C) com 1 mL de meio de congelamento para cultivo celular Recovery TM (Thermo Fisher Scientific) para isolamento de RNA. Parâmetros bioquímicos e inflamatórios Os níveis de colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL, triglicerídeos, glicose e proteína C-reativa ultrassensível foram determinados usando analisadores bioquímicos automáticos da marca Bioclin ® (Bioclin BS-120 Chemistry Analyzer). Calculou‑se o colesterol LDL pela equação de Friedewald et al., 24 Análise da PCR quantitativa em tempo real As expressões de mRNA dos fatores de transcrição NF‑ κ B, NQO1 e PPAR β / δ foram avaliadas pela PCR quantitativa em tempo real (qPCR) de PBMCs de acordo com Cardozo et al. 2016. 25 Foram utilizados os ensaios de expressão gênica TaqMan ® (Applied Biosystems) para detectar a expressão de mRNA dos fatores Nrf2 (Hs00975961_g1), NF- κ B (Hs00765730_m1), NQO1 (Hs00168547_m1), PPAR β / δ (Hs00975961_g1) e o gene de controle GAPDH (Hs02758991_g1). Análise estatística O teste Shapiro-Wilk foi aplicado para testar a distribuição das amostras. Os resultados foram expressos em média ± DP (idade, IMC, PAS, perfil lipídico, glicose, Nrf2, NF- κ B, NQO1, PPAR β / δ ), mediana (intervalo interquartil) (PCR) ou porcentagem (hipertensão, dislipidemia, diabetes), conforme aplicável. Utilizou-se o teste t de Student não pareado para comparar as variáveis e grupos com distribuição normal e o teste de Mann-Whitney-Wilcoxon para dados não paramétricos. As correlações entre as variáveis foram avaliadas pela correlação dos coeficientes de Pearson ou Spearman de acordo com a distribuição da amostra. Aceitou-se 5% como nivel de significância. As análises estatísticas foram realizadas com software SPSS 19.0 (Chicago, IL, EUA). Resultados No grupo com DAC, 82,8% apresentaram alterações na cintilografia de perfusão miocárdica (65,5% isquemia miocárdica, 27,6% fibrose miocárdica, e 6,9% de fibrose e isquemia miocárdica). Quanto à duração da doença, 71,4% foram diagnosticados com DAC de 1 a 5 anos, 17,1% de 6 a 10 anos e 11,5% de 10 a 15 anos. De acordo com a história clínica dos pacientes com DAC, 54,2% realizaram algum tipo de procedimento antes do estudo: 8,7% realizaram cateterismo cardíaco, 34,3% angioplastia coronariana transluminal percutânea, 5,7% angioplastia coronariana transluminal percutânea e cateterismo cardíaco e 5,7% angioplastia coronariana transluminal percutânea e cirurgia de revascularização miocárdica. Além disso, 62,8% dos pacientes comDAC e 30,8% do grupo controle eram fumantes. Considerando o uso de medicamentos, no grupo com DAC, 68,5% usavam bloqueadores β -adrenérgicos, 17,4% inibidores da enzima conversora de angiotensina, 77,1% estatinas, 28,5% bloqueadores dos canais de cálcio, 51,4% diuréticos, 37,2% nitratos, 54,3% ácido acetilsalicílico, 62,8% losartana potássica, 34,8% hipoglicemiantes orais e 11,43% insulina. No grupo controle, 53,8% usavam bloqueadores β -adrenérgicos, 15,4% inibidores da enzima conversora de angiotensina, 46,2% estatinas, 30,8% bloqueadores dos canais de cálcio, 53,8% diuréticos, 7,7% nitratos, 61,5% ácido acetilsalicílico, 69,2% losartana potássica, 38,5% hipoglicemiantes orais e 7,7% insulina. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos com relação ao uso de medicamentos ou tabagismo. A Tabela 1 apresenta o perfil clínico e os parâmetros bioquímicos. Além disso, o grupo com DAC apresentou menores níveis de colesterol total, colesterol LDL e colesterol HDL quando comparado ao grupo sem DAC (Tabela 1). Não foramencontradas diferenças nos fatores transcricionais Nrf2 e NF- κ B ou na expressão de mRNA do gene NQO1, comparando-se o grupo DAC com o grupo sem DAC. Em contrapartida, houve maior expressão do receptor PPAR β / δ no grupo com DAC (Tabela 2). Consideramos que a inclusão de pacientes diabéticos não interferiu nos resultados. Nenhuma correlação foi encontrada. Discussão Alguns estudos avaliaram a inflamação sistêmica através da expressão gênica das PBMCs. 26,27 Salientou-se a importância de estudar as PBMCs como uma estratégia para avaliar alvos de vias metabólicas relacionadas à inflamação para explorar as DCV para uma melhor compreensão da arquitetura dessas doenças. A hipótese contemplada seria a de que os PBMCs poderiam refletir mecanismos inflamatórios de uma maneira mais específica em comparação com o soro/plasma. 28 Assim, o presente estudo investiga a expressão de mRNA dos fatores transcricionais NF- κ B e Nrf2 e do receptor PPAR β / δ nas PBMCs de pacientes com DAC. Os pacientes com DCV geralmente estão expostos a inflamação e estresse oxidativo. O fator Nrf2 protege o organismo contra essas alterações, pois está relacionado à síntese de enzimas antioxidantes e é capaz de antagonizar o NF- κ B envolvido na indução inflamatória. Diversos estudos mostraram que o fator NF- κ B desempenha um papel importante no desenvolvimento de DCV. 29–31 Demonstrou-se que a isquemia induziu rapidamente a ativação do NF- κ B no miocárdio de ratos. 29 Wilson et al., 30 mostraram que o NF- κ B encontrava-se aumentado na placa ateromatosa coronariana em humanos e sua expressão estava predominantemente associada a macrófagos, células espumosas e células musculares lisas vasculares. Além disso, sua expressão mostrou-se 1123