ABC | Volume 113, Nº1, Julho 2019

Artigo Original Wollmann et al Caracterização do pericárdio descelularizado Arq Bras Cardiol. 2019; 113(1):11-17 St. Louis, USA) a 0,1% P/V. Em seguida, foram lavados com etanol a 70% (V/V) por 24 horas em temperatura ambiente, seguido de 10 dias de lavagem com cloreto de sódio (0,9%) para remoção de substâncias residuais e fragmentos celulares. Análise histológica Cortes longitudinais de 3,0mm foram fixados com formalina tamponada neutra a 10% e em seguida em parafina. Cortes de 4 μm de espessura foram depois realizados. Para análise da integridade morfológica do pericárdio, realizou-se marcação com hematoxilina e eosina (H&E) e Russell-Movat (RMP), e utilizou-se um microscópio ótico BX51 (Olympus Tóquio, Japão). Pericárdio fresco foi usado como controle para avaliar mudanças causadas pela descelularização. As lâminas foram examinadas utilizando-se um scanner Axio Scan.Z1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha), e o preparo das imagens foi realizado usando-se o programa Zen lite (Carl Zeiss, Jena, Alemanha). Extração e quantificação de DNA A quantificação de DNA foi usada para determinar o total de DNA remanescente comparando-se seus níveis no pericárdio fresco e no pericárdio descelularizado. As amostras de tecidos foram pesadas, purificadas e reidratadas usando-se o kit QIAGENDNeasy para amostras de sangue ou tecido (QIAGEN, Valencia, EUA), seguindo-se protocolo recomendado. A concentração de DNA extraído foi determinada usando o espectrofotômetro Nanodrop (ThermoFisher Scientific, Wilmington, EUA). A amostra de DNA extraída (1 µL) foi colocada no Nanodrop, e a absorbância determinada a 260 nm. Foram realizadas quatro leituras para cada amostra, e a média foi considerada como a absorbância da amostra. A concentração de DNA foi calculada e expressa em microgramas por miligrama de tecido seco. Caracterização bioquímica Glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) O pericárdio foi digerido com uma solução de papaína a 60 o C por 6 horas. A papaína (Sigma, St. Louis, MO) foi dissolvida a 400 mg/mL em tampão fosfato 0,1 M (pH 6,0) contendo hidrocloreto de cisteína 5mM e EDTA 5mM. Os produtos da lise foram usados para detecção da quantidade de GAGs, a qual foi medida usando-se o kit Blyscan (Biocolor, Newtownabbey, Reino Unido), seguindo-se o manual do fabricante. O lisado de tecido foi misturado com o corante Blyscan para esse se ligar ao GAG. O complexo GAG-corante foi então coletado por centrifugação. Subsequentemente, o sobrenadante foi removido, o tubo drenado, e em seguida adicionou-se o reagente de dissociação. A solução foi então transferida para uma placa de 96 poços. A absorbância em relação ao controle de referência foi obtida a um comprimento de onda de 656 nm em um espectrofotômetro VersaMax TM (Molecular Devices, Sunnyvale, EUA). A quantidade de GAGs foi calculada com base na curva padrão obtida com o GAG padrão do kit. Colágeno A concentração de colágeno no pericárdio foi determinada pelo ensaio Sircol (Biocolor, Newtownabbey, Reino Unido), seguindo-se as instruções do fabricante. Os pericárdios foram incubados a 48oC por 48 horas em ácido acético 0,5M contendo pepsina 0,1 mg/mL. As amostras foram adicionadas ao corante Sircol, e os complexos colágeno‑corantes foram formados e precipitados. Após a centrifugação, o precipitado foi lavado uma vez com solução de lavagem e suspenso em reagente alcalino. A solução foi transferida para uma placa de 96 poços e a leitura da absorbância realizada pelo espectrofotômetro VersaMax TM (Molecular Devices, Sunnyvale, EUA) a 550 nm. A quantidade de colágeno foi calculada com base em uma curva padrão obtida com colágeno tipo I bovino padrão fornecido no kit. Análise de citotoxicidade A citotoxicidade do pericárdio descelularizado foi avaliada de acordo com ISO 10993/5. Fibroblastos L929 (ATCC linhagem CCL 1, NCTC clone 929) foram semeados em placas de seis poços (Nest) em uma densidade de 1x10 5 células/poço. Em c2mM + soro bovino fetal 10%. As placas foram incubadas por 48 horas a 37 o C em ambiente controlado (5% ± 0,5% de CO 2 ) até que se obtivesse uma monocamada, em confluência superior a 80%. O meio foi removido dos poços e substituído com ágar 1,8% e corante vermelho neutro a 0,01%. Amostras em triplicata, controle positivo, negativo e branco sobre a camada de ágar configuraram as placas. Após incubação por um período de 24 horas a 37 o C em atmosfera umidificada (5% ± 0,5% de CO 2 ), mediu-se a zona de inibição ao redor das amostras, uma vez que o vermelho neutro não contém células mortas. A reatividade biológica das amostras foi classificada de 0 a 4 de acordo com os seguintes critérios: 0=ausência de citotoxicidade (ausência de uma zona de lise sob a amostra); 1=leve (zonas de lise celular somente sob a amostra); 2=baixa (zonas de lise celular ≤5 mm da amostra); 3=moderada (zonas de lise celular >5 mm e ≤10 mm da amostra); 4=grave (zonas de lise celular >10 mm, sem envolver o poço inteiro. Além disso, os poços foram examinados com um microscópio invertido (Nikon Eclipse TS 100; Nikon) para avaliar alterações celulares. Estudo biomecânico O estudo biomecânico do pericárdio humano foi realizado pelo teste de tração para comparar os efeitos de descelularização sobre as propriedades teciduais de resistência de tração, alongamento e módulo de elasticidade. Os testes foram realizados pela máquina universal EMIC DL 500. Foram utilizadas oito amostras de tecido fresco e seis amostras de tecido descelularizado, e a direção de tração das fibras de colágeno foi aleatória. A amostra (forma de halteres, do inglês dumbbell-shaped ) foi baseada no padrão ASTM D1708-13 devido ao pequeno tamanho do tecido disponível. Para obtenção das amostras, foi necessário a fabricação de um cortador de aço, seguindo-se especificações 13