ABC | Volume 112, Nº2, Fevereiro 2019

Artigo Original Maifrino et al Efeitos do exercício em ratas ovariectomizadas Arq Bras Cardiol. 2019; 112(2):180-188 180º e 270º, com ampliação de 10x para medir a espessura da aorta e 40x para outras avaliações, e transferidas para um programa de análise de imagens (Axion Visio Software, Zeiss ® ). Para analisar a densidade volumétrica das fibras colágenas tipos I e III, as imagens foram obtidas em microscópio ótico com luz polarizada, analisadas em sistema teste de 252 pontos, e os valores expressos em porcentagens. Análise imunohistoquímica: 8-OHdG, MMP-2 e MMP-9 Cinco seções transversais de 4 µm, montadas em lâminas previamente silanizadas, foram utilizadas para demonstrar a expressão de 8-OHdG, MMP-2 e MMP-9. As lâminas foram então desparafinizadas, limpas, hidratadas e lavadas em água corrente. Em seguida, a atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 0,3%, o bloqueio de proteínas foi realizado com leite desnatado a 0,3% diluído em PBS e as lâminas foram incubadas durante a noite com anticorpo primário anti-8-OHdG (SC66036 Santa Cruz ® Biotechnology, CA, EUA), titulado a 1:100 e MMP2/72KDa e MMP9/KDa (SC-10436 Santa Cruz® Biotechnology, CA, EUA; SC-6840 Santa Cruz® Biotechnology, CA, EUA),titulado a 1: 150 em PBS-BSA 0,1%. Todas as lâminas foram então colocadas numa câmara úmida a 4°C durante a noite. O material foi lavado com tampão PBS e incubado com anticorpo secundário biotinilado. Para revelação, o substrato cromogênico 3-3’ diaminobenzidina foi utilizado na proporção de 0,06 g por 100 mL de PBS, e 1 mL de H 2 O 2 a 20 volumes por cinco minutos a 37 °C e contra-corado com hematoxilina de Mayer por 3 minutos. Finalmente, as lâminas foram montadas com lamínula e Entellan ® para análise sob microscopia ótica. Investigação da morte celular por apoptose pelo método imunocitoquímico de TUNEL A coloração TUNEL ( Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling ) foi realizada utilizando-se o kit ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection (Millipore ® , Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Quantificação de células apoptóticas Para a quantificação das células imunomarcadas para apoptose, foramcapturadas 30 imagens da camada íntima-média (10 imagens/animal; n=3 animais/grupo), comaumento de 10x para medir a espessura da aorta e 40x para outras avaliações, e transferidas para um programa de análise de imagens (Axion Visio Software, Zeiss ® ) para cada grupo experimental. Para cada imagem, onúmero total de células imunomarcadas foi obtido como uma frequência relativa (%) em relação ao número total de células. O microscópio ótico acoplado a uma câmera digital (Zeiss, Alemanha) foi utilisado para obter as imagens, e as fotomicrografias foram digitalizadas com o software AxioVision (Zeiss ® , Alemanha). Análise estatística Os resultados foram apresentados como média e desvio padrão. A análise de variância (ANOVA) e os testes post-hoc de Tukey foram aplicados adequadamente na análise dos dados. O nível de significância para todos os testes foi de p < 0,05. Os dados foram avaliados utilizando-se o software Stata 7.0. Todas as variáveis contínuas estavam distribuídas normalmente (teste de Shapiro-Wilk). Para avaliar a normalidade dos dados, foi utilizado o cálculo de Shapiro-Wilk, que mostrou que os dados estavamalocados dentro da curva deGauss. Considerando‑se um nível de significância de 5%, o teste assumiu a hipótese de normalidade para a variável com distribuição normal. Resultados Análise histopatológica e histomorfométrica A análise histopatológica mostrou que os animais dos grupos controle (CS, CSO e CTO) não apresentaram alterações no arranjo das fibras elásticas e no padrão de espessura. No entanto, os grupos dislipidêmicos (S-LDL KO, SO-LDL KO e TO-LDL KO) apresentaram maior espaçamento entre as fibras elásticas (Figura 1). Espessura da túnica íntima-média (µm) Observamos um aumento significativo na espessura da túnica íntima-média em animais dislipidêmicos, quando comparados aos animais dos grupos controle. A ovariectomia e o exercício nos grupos LDL KO foram determinantes para o aumento dessa variável. Tanto no grupo controle quanto no grupo LDL KO o exercício de treinamento não reverteu esse processo (Figuras 1 e 2). Densidade de volume das fibras de colágeno tipos I e III na túnica íntima-média e adventícia Comportamento semelhante da fibra de colágeno tipo III foi observado entre a túnica íntima-média e a adventícia. Observamos uma diminuição significativa na densidade de volume da fibra de colágeno tipo III nos grupos LDL KO, quando comparados com o CS (Figura 3). As fibras de colágeno tipo I da túnica adventícia e da íntima-média apresentaram aumento na densidade de volume, influenciado pelo treinamento nos grupos Controle. A dislipidemia induz a um aumento das fibras de colágeno tipo I nos grupos LDL KO quando comparado aos grupos Controle e não sofreram nenhuma alteração causada pela ovariectomia ou pelo treinamento (Figura 3). Análise imunohistoquímica A Figura 4 mostra a coloração do tecido causada pelo marcador de estresse oxidativo 8-OHdG. Observe que a imunoexpressão do marcador ocorreu em todos os grupos. A coloração foi moderada para os grupos LDL KO e Controle, tanto Sedentário quanto Ovariectomizado. No entanto, para os grupos Ovariectomizados e treinados, a coloração observada foi intensa. Em todos os grupos controle (CS, CSO e CTO), a imunoexpressão de MMP-2 ocorreu tanto na túnica íntima (seta) quanto na adventícia (cabeça de seta) da aorta ascendente. Os grupos LDL, em geral, mostraram imunoexpressão da MMP-2 além das túnicas íntima e 182