ABC | Volume 112, Nº2, Fevereiro 2019

Artigo Original Naderi et al Alho e exercícios aumentam a angiogênese cardíaca Arq Bras Cardiol. 2019; 112(2):154-162 Extração do miRNA e PCR em tempo real O miRNA foi extraído do miocárdio utilizando-se um kit de isolamento miRCURYTMRNA (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) conforme o protocolo do fabricante. 20,21 O procedimento foi realizado com base em coluna de spin, utilizando-se uma resina proprietária como matriz para separar o RNA de outros componentes celulares. O conteúdo a pureza do RNA foram medidos com o espectrofotômetro Nanodrop 1000 (Thermo scientific, Wilmington, DE 19810 EUA). Operfil de expressão do MiRNA-126 foi obtido para os extratos de RNA total utilizando‑se um kit universal de síntese de cDNA. Resumidamente, o RNA total contendo microRNA foi poliadenilado, e o cDNA foi sintetizado utilizando-se um iniciador poli(T) com uma âncora 3’ degenerada e um marcador universal 5’ (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca). Cada cDNA foi utilizado como matriz para PCR quantitativo em tempo real de microRNA, utilizando-se a mistura principal SYBR Green (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca). Os conjuntos de iniciadores diretos e reversos de ácido nucléico bloqueado (LNA) (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) paramicroRNA estão listados na Tabela 1. As reações de PCR em tempo real foram realizadas com um sistema de detecção Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA). A quantidade de produtos de PCR foi normalizada com rno-miRNA-191 para o miRNA-126 e o miRNA-210. 37 Utilizamos o método 2 -(ΔΔCt) para determinar os níveis quantitativos relativos de miRNA-126 e miRNA-210. Os resultados foramexpressos como diferença (razão) em relação os controles relevantes. Imunocoloração para PECAM-1/CD31 Para investigar a angiogênese no miocárdio, secções transversais dos ventrículos, realizadas em sua porção intermediária, foram imediatamente isoladas e fixadas em solução de formalina tamponada a 10%, desidratadas em graus ascendentes de álcool e embebidas em parafina. Em seguida, cortes seriais de 3µm de espessura foram cortados e flutuados em lâminas de vidro carregadas conforme o processamento histológico padrão. Os pedaços de tecido foramdesparafinados em xileno e desidratados em uma série graduada de etanol. As lâminas foram incubadas sequencialmente em proteinase K e 0,3% de peróxido de hidrogênio, para bloquear a atividade da peroxidase endógena. As secções foram cobertas pelo anticorpo primário CD31 (Santa Cruz, EUA) – um marcador de angiogênese – e incubadas a +4 °C durante a noite. Depois, as secções foram lavadas e incubadas com complexo avidina-biotina padrão (ABC; Santa Cruz) conforme o protocolo. Em seguida, as lâminas foram incubadas em DAB (Diamino‑benzidina, Santa Cruz) como cromato, e contra‑coradas com a hematoxilina de Mayer. Finalmente, as secções foram limpas em xileno, montadas com Entellan e analisadas com um microscópio de luz. Avaliação de imunocoloração Para avaliar a imunocoloração, 3 a 5 secções de 1 mm 2 foram selecionadas aleatoriamente em uma ampliação de 400×, dependendo do tamanho da secção da amostra. Tanto a intensidade da coloração quanto o número de células positivas foram avaliados semi-quantitativamente. A classificação da intensidade de coloração do CD31 foi obtida dentro de cada área, em uma ampliação de 400x. Cada aglomerado de células endoteliais com CD31 expressando imunorreatividade, bem como lúmen ou vasos em formação, foram contados como microvasos individuais. Estruturas vasculares positivas para CD31 foram contadas para 5 a 6 lâminas por animal e 10 campos por lâmina. Para avaliar a imunocoloração, utilizou-se o tecido de granulação como controle positivo, e a intensidade da coloração foi classificada da seguinte forma: 0 (< 10%); 1 (10% a 25%); 2 (25% a 50%); 3 (50% a 75%) ou 4 (75% a 100%). 22 Medição do perfil lipídico Amostras de sangue foram obtidas da veia cava inferior, centrifugadas a 3500 rpm, por 10 minutos, a 4°C, e o soro foi coletado. O nível sérico de triglicerídeos foi determinado por kits enzimáticos (ZiestChem Diagnostic kits, Irã), utilizando‑se o glicerol como padrão. Adicionalmente, os níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) e lipoproteína de baixa densidade (LDL) foram determinados com base em métodos enzimáticos através de kits de diagnóstico, (ZiestChem, Irã) utilizando-se o colesterol como padrão. Análise estatística Todos os resultados foram expressos como média ± EPM para sete animais, e as análises foram realizadas com o software estatístico SPSS, versão 16. Todos os parâmetros foram testados para normalidade usando o teste de Kolmogorov-Smirnov de uma amostra. Os dados foram analisados estatisticamente utilizando-se a análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida do teste de Tukey. O nível de significância foi estabelecido em p < 0,05. Resultados Efeitos do alho e dos exercícios voluntário sobre o miRNA-126 no miocárdio Como mostrado na Figura 1, o nível de expressão do miRNA-126 no miocárdio foi significativamente mais baixo (p < 0,05) em ratos com diabetes do que no grupo controle. O tratamento com alho (p < 0,001), exercício voluntário (p < 0,01), ou ambos em conjunto aumentaram Tabela 1 – Lista de sequências-alvo para os miRNAs Nome do gene Número de acesso Sequência-alvo* rno-miRNA-191 MIMAT0000440 CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG hsa-miRNA-126 MIMAT0002957 UCGUACCGUGAGUAAUAAUGC dme-miRNA- 210 MIMAT0001233 UUGUGCGUGUGACAGCGGCUA * As sequências foram obtidas no miRNABase (www.mirbase.org ). 156