ABC | Volume 112, Nº1, Janeiro 2019

Artigo Original Jevjdovic et al Estresse pré-natal afeta ADRB1 no coração de ratos Arq Bras Cardiol. 2019; 112(1):67-75 de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações totais de RNA foram quantificadas por medidas de absorvância a 260 e 280 nm utilizando um espectrofotômetro (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade de RNA foi analisada gel de agarose a 1,5 % com brometo de etídio e observada por transiluminação UV (ChemiDoc-It imager, UVP, Alemanha). Síntese do cDNA e PCR quantitativa em tempo real Amostras de RNA (2 µg) foram submetidas ao tratamento de DNase I, utilizando rDNase I, de acordo com o protocolo do fabricante (DNA-free kit, Ambion, EUA). Esferas Ready- to-go You-Prime First-Strand (GE Healthcare, USA) foram utilizadas para gerar cDNA para subsequente PCR quantitativa em tempo real. Amostras sem transcriptase reversa foram utilizadas para controlar a possível contaminação com gDNA. Todas as reações foram realizadas em duplicado utilizando TaqMan Master Mix (Applied Biosystems) uma vez e TaqMan expression assays uma vez para cada gene (Tabela 2: Adrb1, Adrb2, Adrb3, MaoA, ActB), com 2 µg de cDNA dentro de um volume total de 20 µl. Reações de PCR em tempo real foram realizadas no Applied Biosystem 7900 Real-Time PCR System, utilizando condições padrões de PCR (50°C durante 2 min; 95°C durante 10 min; 95°C durante 15 s e 60°C durante 1 min para 40 ciclos). Os níveis relativos de expressão gênica foram determinados pelo método 2ˆ(- ∆∆ C T ) de quantificação comparativa, 22 usando beta-actina como gene de referência. Análise estatística Realizou-se análise estatística utilizando GraphPad Prism Software-version 6.01 (San Diego, EUA). Os parâmetros medidos nas mães e na prole foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Os dados foram analisados pelo teste t de Student não pareado, a menos que indicado de outra forma. Os dados da prole obtidos por análise de PCR em tempo real foram expressos como mediana com intervalo interquartílico. Utilizou-se análise ANOVA two-way com teste de comparação múltipla de Bonferroni para examinar os efeitos de estresse pré-natal e de gestação nos níveis ACTH no plasma materno e os efeitos do estresse pré-natal nos padrões de expressão dos genes ADRB nas regiões examinadas do ventrículo esquerdo da prole. Avaliou‑se a significância estatística das diferenças entre os dados de PCR em tempo real obtidos dos grupos experimentais com o teste U de Mann-Whitney não paramétrico. O nível de significância foi estabelecido em p < 0,05. Resultados Efeitos do ECMI nos parâmetros das mães e da prole Para determinar se o protocolo de estresse aplicado ativou o eixo HPA nas ratas prenhes, os níveis plasmáticos maternos de ACTH foram avaliados. Antes do início do protocolo de estresse (GD13), os níveis plasmáticos maternos de ACTH não foram significativamente diferentes entre os grupos experimentais (Figura 1). Após exposição aleatória e intermitente a uma variedade de estressores durante a terceira semana da gestação (GD13-21), os níveis plasmáticos maternos de ACTH aumentaram em comparação com controle (Figura 1, p<0,001, ANOVA two-way com teste de comparaçãomúltipla de Bonferroni). Adicionalmente, no grupo de mães estressadas, após a exposição a diversos estressores, os níveis plasmáticos de ACTH aumentaram em comparação comGD13, sugerindo que o eixo HPA foi ativado neste grupo experimental (Figura 1, p<0,001, ANOVA two‑way com teste de comparaçãomúltipla de Bonferroni). A ECMI não afetou o ganho de peso materno na última semana da gestação (Tabela 3) ou o consumo de água e de alimentos durante a gestação (dados não mostrados). Os níveis de glicose materna foram semelhantes nos dois grupos experimentais antes e depois da aplicação do protocolo de ECMI (Tabela 3). O estresse pré-natal não acarretou um efeito no tamanho das ninhadas ou na relação machos/fêmeas na prole (Tabela 3). O estresse materno Tabela 1 – Regime de estresse 10:00-11:00 14:00-15:00 18:00-08:00 GD14 Contenção Cama úmida Inclinação da gaiola GD15 Ambiente frio (4°C) Deslocamento e barulho Iluminação contínua GD16 Cama úmida Contenção Inclinação da gaiola GD17 Deslocamento e barulho Ambiente frio (4°C) Iluminação contínua GD18 Contenção Cama úmida Inclinação da gaiola GD19 Ambiente frio (4°C) Deslocamento e barulho Iluminação contínua GD20 Cama úmida Contenção Inclinação da gaiola * GD: Dia da gestação. Tabela 2 – Ensaios de expressão TaqMan Gene TaqMan ID de ensaio Receptor adrenérgico beta 1 ( Adrb1 ) Rn00824536_s1 Receptor adrenérgico beta 2 ( Adrb2 ) Rn00560650_s1 Receptor adrenérgico beta 3 ( Adrb3 ) Rn01478698_g1 Monoamina oxidase A ( Maoa ) Rn01430955_A1 Beta-actina ( Actb ) Rn01412977_g1 69