ABC | Volume 112, Nº1, Janeiro 2019

Artigo Original Jevjdovic et al Estresse pré-natal afeta ADRB1 no coração de ratos Arq Bras Cardiol. 2019; 112(1):67-75 Introdução Dados recentes de estudos epidemiológicos e experimentais apontam que distúrbios no ambiente intrauterino estão relacionados ao aumento do risco de desenvolver patologias mais tarde na vida. Observou-se umaumento na suscetibilidade à hipertensão adulta em prole prenatalmente exposta a nutrição materna desequilibrada, 1-3 glicocorticóides sintéticos, 4 ou estresse materno. 5 Reconhece-se há muito tempo que exposição a estresse pré-natal resulta em aumento na atividade do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) e do sistema nervoso simpático (SNS) na idade adulta 6,7 Atividade desregulada do SNS é uma característica marcante de distúrbios cardiovasculares. Portanto, não é surpreendente que os principais alvos farmacêuticos no manejo desses distúrbios sejam principalmente moduladores da atividade dos receptores adrenérgicos. Os efeitos cardiotóxicos das catecolaminas são mediados principalmente por superestimulação persistente ou aguda dos receptores adrenérgicos β (ADRB). 8 São presentes três subtipos de ADRB no coração humano saudável, sendo o ADRB1 o mais comum e ADRB3 o menos. 9,10 Na subpopulação ADRB1, a regulação negativa é uma das características moleculares das patologias cardíacas, como a insuficiência cardíaca humana. 9,11 Além disso, estudos com animais transgênicos demonstram que os efeitos iniciais da superexpressão do ADRB2 levam ao aumento da contratilidade cardíaca. 12 Porém, mais tarde na vida esses animais transgênicos desenvolveram disfunção ventricular. 13 Além disso, outra condição patológica miocárdica desencadeada por catecolaminas circulantes elevadas é definida por uma disfunção contrátil específica da região, principalmente apical, dentro do ventrículo esquerdo. 14 Adicionalmente, a cardiotoxicidade pode resultar da produção de espécies reativas do oxigênio (ROS) na degradação de catecolaminas pela monoamina oxidase A (MAO-A) no coração. 15 Aumenta-se a expressão e atividade de MAO-A cardíaca em vários modelos animais de insuficiência cardíaca 16-18 e envelhecimento. 19 Estudos epidemiológicos mostram que pacientes femininos e masculinos de doença cardiovascular apresentam respostas diferenciais a diversos tratamentos recomendados. 20,21 Este fato enfatiza a necessidade de incluir os dois sexos em pesquisa cardiovascular. Para entender melhor os mecanismos moleculares pelos quais o estresse pré-natal pode contribuir ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares na vida adulta, o presente estudo foi desenvolvido para investigar a expressão gênica região‑específica dos subtipos de receptores adrenérgicos (ADRB1, ADRB2 e ADRB3) e do MAO-A no miocárdio ventricular esquerdo de prole feminina e masculina. Métodos Animais Ratas Wistar virgens (266 ± 11,9 g), com três meses de idade, foram alojadas no biotério da Faculdade de Biologia da Universidade de Belgrado, com livre acesso a alimento e água, sob ciclo claro-escuro constante (12/12 h) em condições de temperatura controladas (22 ± 1°C). O tamanho da amostra foi determinado por conveniência. Cada um dos seis pares de ratas foi enjaulado comum ratomacho sexualmente experiente durante o ciclo do estro. Indicou-se o dia 0 da gestação com o aparecimento de espermatozóides no esfregaço vaginal. Uma rata não emprenhou-se. Para evitar viés de seleção, as fêmeas prenhes que acasalaram com o mesmo macho foram aleatoriamente designadas para o grupo controle (n = 5) ou estressado (n = 6) e alojadas individualmente. Conduziram‑se todos os procedimentos de acordo com as normas de cuidados com animais propostos pela Federação Europeia das Associações de Ciência emAnimais de Laboratório (FELASA) e aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Biologia da Universidade de Belgrado. Protocolo de estresse pré-natal Durante a terceira semana da gestação (dia gestacional 13-20, GD13-GD20), as ratas prenhes foram expostas a um protocolo de estresse crônico moderado imprevisível (ECMI) que incluiu exposição aleatória e intermitente a uma variedade de estressores. O protocolo detalhado do ECMI é mostrado na Tabela 1. Resumidamente, os animais foram expostos aos seguintes estressores em ordem aleatória duas vezes ao dia durante 1 h ou durante a noite: cama úmida, contenção dentro de um tubo de Plexiglas®, ambiente frio (4°C), deslocamento da gaiola e barulho, iluminação durante a noite e inclinação da gaiola. Mães de controle não foram perturbadas durante a gestação, com exceção do manejo geral. Durante toda a gestação, a ingestão de água e alimentos foi registrada. Exames bioquímicos Antes da primeira e depois da última exposição aos estressores, coletou-se o sangue na veia caudal das ratas prenhes em tubos com EDTA. Os níveis plasmáticos do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) foram medidos com CLIA e os níveis de glicose foram medidos com um analisador de glicose Exac-tech com tiras de reagente Dextrostix, de acordo com as instruções dos fabricantes em todos os casos. Ninhadas Ao nascimento, os filhotes foram contados e pesados e as ninhadas foram ajustadas para oito filhotes com um número igual de machos e fêmeas para evitar os efeitos de tamanho e distribuição sexual da ninhada no desenvolvimento. Todos os filhotes foram criados por suas mães biológicas. Os filhotes foram desmamados aos 28 dias, separados por sexo e alojados em grupos de dois por gaiola, de acordo com o grupo experimental (C- prole de mães não-estressadas, PS- prole de mães estressadas). O peso corporal e o consumo de alimentos e de água foram registrados durante os períodos pré- e pós- desmame. A prole foi sacrificada por decapitação aos dois meses de idade. Para evitar flutuações dependentes do ciclo estrogênico, a prole feminina foi sacrificada em diestro, que foi verificado por esfregaços vaginais. Isolação de RNA O RNA total das porções basais e apicais dos ventrículos esquerdos foi isolado com o reagente TRI (Sigma, Alemanha) 68