ABC | Volume 112, Nº1, Janeiro 2019

Artigo Original Arq Bras Cardiol. 2019; 112(1):3-10 Tianshu-Chu et al Rapamicina em combinação com α -cianoacrilato Ensaio de imunoabsorção enzimática para ET-1 ET-1 foi determinado com kits ELISA (R&D, USA) utilizando 50 μl de soro para o ensaio. Foram realizadas 3 medidas para cada amostra de sangue e a placa de ELISA foi lida a 450 nm em um leitor de placas. Exame histológico do tecido enxertado As veias enxertadas foram imersas em formalina e cortadas em seções de 4 mm. Subsequentemente, realizou-se coloração hematoxilina-eosina (HE) utilizando um kit de coloração hematoxilina e eosina (Beyotime Biotechnology, Shang Hai, China). O sistema de aquisição de imagem do microscópio Olympus foi utilizado para obter imagens de seção (lente objetiva 100 ×) e medir a espessura da íntima. As medidas e a análise de dados foram realizadas por 2 pesquisadores independentes. As seções foram selecionadas aleatoriamente de veias enxertadas e não-enxertadas; em seguida medimos 16 pontos de espessura e calculamos a média. Três seções foram selecionadas e medidas de cada rato. Em seguida, calculamos a espessura da íntima. Determinação do índice de proliferação As seções de tecido foram incubadas com o kit de análise imuno-histoquímica para o antígeno nuclear de células em proliferação (PCNA) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA) a 4°C durante uma noite. Após a lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (DAKO, Glostrup, Dinamarca) e incubação com o anticorpo secundário, realizou-se a coloração comDAB. As secções de tecido foram desidratadas e instaladas em lâminas. Todas as imagens (lente objetiva 200 ×) foram captadas pelo sistema de aquisição de imagem do microscópio Olympus e pela SPOT Digital Camera (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, EUA). Células positivas para PCNA foram contadas na íntima. Utilizou-se um total de 10 vistas de observação para calcular a percentagem média de células positivas para PCNA para cada rato. RT-PCR O RNA total dos tecidos dos vasos foi isolado com o Kit TRIzol (Life Technology, USA). A transcrição reversa foi utilizada para obter cDNA a partir do RNA por meio do Kit de Transcrição Reversa de RNA (Promega, EUA). Um total de 2 μg de RNA e 1 μl de primer randômico foram desnaturados a 70°C durante 10 min e anelados a 4 °C durante 10 min. Em seguida, 2 μL de tampão 10 ×, 2 μl de MgCl 2 (20,8 mol/l) e 1 μL de transcriptase reversa foram adicionados ao sistema de reação. Acrescentou‑se água duplamente destilada (ddH 2 O) para levar o volume a 20 μl. As condições para síntese do cDNA eram de 37°C durante 1 h e 4°C durante 10 min. O PCR também continha 10 μl de 2 × SYBR Mixture (Takara, Japão), 7 μl de ddH 2 O, 1 μl de forward primer e 1 μl de reverse primer. As condições de PCR eram de 95°C durante 5 min, 95°C durante 15 s, 60°C durante 60 s e 40 ciclos. As sequências dos primers utilizados para RT-PCR eram as seguintes: Forward, 5'-CATCTCCGTGGTCCTGAAGT-3' e reverse, 5'-GGCAAGGGAAACGTCTAGTG-3' para fator de von Willebrand; forward, 5'-CAGAGTCCAGCACAATACCAG-3' e reverse, 5'-GACCCAGATTATGTTTGAGACC para α -actina do músculo liso; e forward, 5'-ACATGAATGACCTCGTCTCTGA-3' e reverse, 5'-CCTCTTCTTCTGCCTCCTCTCC-3' para GAPDH. O instrumento para PCR quantitativo em tempo real foi adquirido de ABI (EUA). Análise estatística Todos os dados foram analisados com o software de análise estatística SPSS 17.0. Os dados são expressos como média ± desvio padrão. Visto que os dados mostraram uma distribuição normal, a comparação entre os vários grupos foi analisada por análise de variância de fator único (ANOVA) e a comparação entre dois grupos foi realizada pelo teste de diferença mínima significativa (LSD) de Fisher. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Resultados Os ratos sobreviveram bem 4 semanas após a operação O procedimento de operação descrito anteriormente foi utilizado para construir modelos de enxerto da veia jugular na artéria carótida em ratos, em um lado. No pós-operatório, as veias transplantadas estavam bem preenchidas e os vasos sanguíneos batiam bem; a cola estava uniformemente espalhada na superfície das veias dos grupos α -CA e α -CA-RPM. O estado vital e as incisões dos ratos foram verificados todos os dias. Subsequentemente, descobrimos que um rato no grupo RPMe umno grupo α -CA tinhammorrido de temperatura baixa 2 semanas depois da operação; os outros ratos sobreviveram e recuperaram-se bem, com pulso forte nas veias enxertadas. Os ratos foram sacrificados 4 semanas após a cirurgia; notavelmente, apenas 2 ratos apresentaramoclusão venosa, um no grupo α -CA e um no grupo RPM. Correspondentemente, o fluxo sanguíneo nas outras veias enxertadas era patente. As veias no grupo sham tinham se expandido levemente. Além disso, as veias do grupo controle tinham novo tecido de granulação, tubos mais espessos, edema e rigidez leve; porém, as veias dos grupos α -CA, RPM e α -CA-RPM tinham poucos tecidos novos que eram facilmente separados, sem expansão óbvia e claramente divididos dos tecidos ao redor e a cola não estava completamente degradada (Figura 1). α-CA-RPM reduziu espessamento intimal dos enxertos venosos Com a finalidade de observarmos os impactos que a intervenção de cada grupo teve na hiperplasia intimal, realizamos coloração das veias enxertadas 4 semanas após a operação. Após isso, utilizamos um sistema de análise de imagens de computador para analisar hiperplasia intimal. Isto revelou que a íntima do grupo controle era notavelmente mais espessa que a dos grupos α -CA, RPM e α -CA-RPM; a diferença era estatisticamente significativa (91,3 ± 3,9, 133,6 ± 8,0, 50,6 ± 5,4 vs. 233,6 ± 29,1 μm; p < 0,01; Figura 2B, C, D, E e F); a íntima do grupo RPM era mais espessa do que a do grupo α -CA; a diferença era estatisticamente significativa (133,6 ± 8,0 vs. 91,3 ± 3,9 μm; p < 0,05; Figura 2C, D e F); a íntima dos grupos α -CA e RPM era mais espessa do que a do grupo α -CA-RPM; a diferença era estatisticamente significativa (50,6 ± 5,4 vs. 91,3±3,9 μm, 133,6±8,0 μm; p<0,05; Figura 2 C, D, E e F). 5