ABC | Volume 111, Nº4, Outubro 2018

Artigo Original Yang et al ApoJ na hiperplasia neointimal Arq Bras Cardiol. 2018; 111(4):562-568 Introdução A doença coronária é uma das doenças cardiovasculares mais comuns, com alta morbidade emortalidade. As principais técnicas consideradas eficazes para revascularização do miocárdio são a intervenção coronária percutânea (ICP) e a cirurgia de bypass coronário. A angioplastia coronária transluminal percutânea (ACTP) é um método eficaz para o tratamento da doença coronária, mas seu efeito em longo prazo é influenciado por uma alta taxa de reestenose. Apesar de stents farmacológicos, combinados à terapia antiplaquetária dupla, reduzirem a ocorrência de reestenose, a taxa de incidência ainda excede 10%. 1,2 O mecanismo da reestenose após a ICP tem sido amplamente estudado em todo o mundo, porém, alvos moleculares ou celulares eficazes para o tratamento da reestenose após ICP precisam ser identificados urgentemente. A clusterina (CLU), ou apolipoproteína (Apo) J, é uma glicoproteína heterodimérica composta por subunidades α e β , ligadas por uma ponte dissulfeto. 3,4 O gene que codifica a Apo J está localizado no cromossomo 8p21-p12, e codifica duas principais isoformas – CLU secretória (CLUs) e CLU nuclear (CLUn). 5 Estudos prévios relataram que a Apo J é induzida durante a progressão da reestenose pós-angioplastia e da aterosclerose. 6-9 No entanto, o papel da Apo J na hiperplasia neointimal é ainda controverso. Há estudos relatando que a Apo J pode estimular a proliferação e a migração de células do músculo liso vascular (CMLV) em ratos knockouts para CLU inibindo a expressão de p53 e p21, e promover reestenose. 10,11 Por outro lado, Kim et al. 12 revelaram que a superexpressão de CLUs pode inibir a migração e a proliferação de CMLV e inibir a apoptose celular. Em vista dos resultados controversos, nosso objetivo foi elucidar o papel da Apo J na hiperplasia neointimal, usando a artéria carótida de ratos in vivo , com ou sem administração de rosuvastatina. Métodos Animais Ratos Wistar machos pesando 350-400g foram divididos aleatoriamente em três grupos – grupo controle (n = 20), grupo modelo (n = 20) e grupo intervenção (estatina) (n = 32). Os ratos de todos os grupos foramentão divididos aleatoriamente em 4 grupos conforme momento de avaliação após lesão induzida com balão –1, 2 3 ou 4 semanas. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do hospital de tórax Tianjin. Lesão com balão Os ratos foram pesados no dia da cirurgia e divididos aleatoriamente em três grupos. No grupo intervenção, os ratos receberam 10mg/kg de rosuvastatina. Um cateter de Fogarty 2F foi introduzido para induzir lesão vascular como descrito anteriormente. 13 Em resumo, os ratos foram anestesiados após injeção intraperitoneal de hidrato de cloral 10% na dose 0,3 mL/100 g de peso corporal. Um cateter balão 2F foi inserido na artéria carótida, saída para a aorta. O balão foi então inflado, desinflado, e puxado para trás três vezes para expor o endotélio. Após 1, 2, 3 ou 4 semanas, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de hidrato de cloral 10% na dose 0,3 mL/100 g de peso corporal e sacrificados após a 4ª semana administrando-se 2-3mL de solução de cloreto de potássio via veia subclávia. A artéria carótida direita foi removida; 0,3 cm foi fixada em formalina neutra a 10% para análise patológica, e a outra parte imediatamente congelada em nitrogênio líquido e armazenado a -80 o C para análise futura. Coloração com hematoxilina e eosina (HE) As amostras do vaso foram fixadas em solução de formaldeído por 3-4 horas. Foram realizadas hidratação e inclusão em parafina de rotina. As seções foram cortadas uniformemente em uma espessura de 4 μm. A lesão dos vasos sanguíneos foi analisada em microscópio. Teste de imuno-histoquímica (IHQ) Os níveis de Apo J foram avaliadas por IHQ na artéria carótida do rato. O anticorpo primário (IgG de coelho anti-Apo J humano) foi comprado da empresa Santa Cruz, Inc. (número no catálogo sc-8354). O anticorpo secundário (anticorpo produzido em cabra anti IgG de rato/coelho) foi adquirido da empresa Maixin BioTech (Fuzhou, China). Todas as fotos foram capturadas e salvas usando o sistema ISCapture, e a coleta e análise de dados realizadas pelo programa de processamento de imagens Image Pro Plus 6. Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) Amostras de sangue venoso foram coletadas e centrifugadas a 3000r/min. O sobrenadante foi coletado usando uma micropipeta e armazenado em geladeira a -20 o C. As amostras foram então descongeladas à temperatura ambiente para serem submetidas ao ELISA, o qual foi realizado usando um kit comercial (Rat Competitive ELISA for Apolipoprotein J A 252 SC) seguindo instruções do fabricante. Reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (Real-time PCR) Os níveis de mRNA da Apo J foram detectadas por PCR em tempo real na artéria carótida do rato. O RNA foi extraído pelo método de extração em fase única com reagente Trizol, e realizada transcrição reversa. Os primers usados para amplificação da Apo J foram: forward , TAA GGA GAT TCA GAA CGC CG; reverse , ATC CCT GGT GTC ATC TAG AG. Os primers para o controle GAPDH foram: forward , GTG ATG CTG GTG CCG AGT AG; reverse , GGT GGC AGT GAT GGC GTG C. As reações de PCR em tempo real foram preparadas seguindo as instruções do sistema SYBR ® Premix Ex Taq ™ (Perfect Real Time). Os níveis de mRNA em cada amostra foram calculados como 2 -ΔΔCt . Western blotting As proteínas foram extraídas de 30mg da artéria carótida de ratos. Em resumo, as proteínas foram separadas por SDS‑PAGE comgel de separação a 10%e gel concentrado a 5%. Em seguida, as proteínas separadas foram transferidas paramembranas PVDF (fluoreto de polivinilideno). As membranas foram bloqueadas 563