ABC | Volume 111, Nº2, Agosto 2018

Artigo Original Rodrigues et al Exercício físico e regulação de cálcio Arq Bras Cardiol. 2018; 111(2):172-179 [composição (mM): 130 Na+; 5,4 K+; 1,4 Mg + ; 140 Cl-; 0,75 Ca 2+ ; 5,0 Hepes ; 10 glicose; 20 taurina; e 10 creatina; pH = 7,3 em temperatura ambiente]. Em seguida, o coração foi perfundido com solução livre de cálcio contendo 0,1 mM de ethylene glycol-bis (ß-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tetraacetic acid (EGTA) , por umperíodo de 4-6min. Na sequência, o coração foi perfundido coma solução de isolamento contendo 1,0mg/mL de colagenase tipo 2 ( Worthington , EUA) e 0,1mg/mL de protease (Sigma-Aldrich, EUA) por 15 a 20 min. As soluções utilizadas foram oxigenadas (O2 100% - White Martins , Brasil) e mantidas em temperatura de 35°C. Após perfusões, os ventrículos foram separados dos átrios e pesados. Em seguida, o VE foi colocado em frasco contendo 5,0 mL da solução enzimática (colagenase + protease). O frasco foi agitado moderadamente durante 05 min, em banho-maria a 37°C, após o qual o tecido foi retirado do frasco e o restante foi centrifugado (3.000 rpm) por 30s. O sobrenadante foi removido e os cardiomiócitos foram suspendidos na solução de isolamento e armazenados em refrigerador (5°C) até serem utilizados. Medida da contratilidade celular As contrações dos miócitos isolados forammedidas por meio da técnica de alteração do comprimento dos cardiomiócitos usando-se o sistema de detecção de bordas (Ionoptix, Milton, MA-EUA) montado num microscópio invertido (Nikon Eclipse - TS100, Japão), conforme descrito previamente. 15 Resumidamente, osmiócitos foramacomodados emuma câmara experimental com a base de vidro e banhados por solução tampão com a seguinte composição (em mM): 136,9 NaCl; 5,4 KCl; 0,37 NaH2PO4; 0,57 MgCl2; 5,0 Hepes = 5; 5,6 Glicose e 1,8 CaCl 2 (pH = 7,4 em temperatura ambiente). Os miócitos foram visualizados em um monitor através de uma câmera (Myocam, Ionoptix, frequência de 240 Hz) acoplada ao microscópio utilizando-se umprograma de detecção de imagens (Ionwizard, Ionoptix). Os cardiomiócitos foram estimulados externamente na frequência de 1,0 Hz (20 Volts, duração de 5 min), em temperatura ambiente (~25°C), utilizando-se um par de eletrodos de platina e um estimulador elétrico de campo (Myopacer, Ionoptix). Os movimentos das bordas longitudinais dos miócitos foram capturados pelo sistema de detecção de bordas (Ionwizard, Ionoptix) e armazenados para análise posterior. Foramutilizados para asmedidas de contração somente os cardiomiócitos que estavam em boas condições, com as bordas e as estriações sarcoméricas bemdefinidas, relaxados em repouso, sem apresentar contrações voluntárias. As contrações foram analisadas conforme descrito previamente. 15 Medida da concentração intracelular de Ca 2+ transitória As medidas da concentração intracelular de Ca 2+ transitória nos cardiomiócitos isolados foram realizadas por meio de sistema de fluorescência (Ionoptix, EUA) montado em um microscópio invertido (Nikon Eclipse – TS100, EUA) equipado com uma lente objetiva de imersão em óleo (S Fluor, 40x, Nikon, EUA), conforme descrito por Natali et al. 16 Em resumo, os miócitos foram incubados com uma sonda de Ca 2+ (5 μM por 10 min) (Fura-2AM, ThermoFisher, Waltham, EUA). A razão entre a fluorescência emitida a 510 nm em resposta a excitações a 340 nm e a emitida em resposta a excitações a 380 nm foi usada como índice da concentração intracelular de Ca 2+ transitória. Os miócitos foram estimulados eletricamente (Myopacer, Field Stimulator, Ionoptix, EUA) por um par de eletrodos de platina com um pulso supra-limiar de 0,2 ms (20V), na frequência de 1 Hz, em temperatura ambiente (~ 25°C). Os parâmetros da concentração intracelular de Ca 2+ transitória foram analisados usando-se o software IonWizard (IonWizard, 6.3, IonOptix, Milton, EUA). Análise de expressão gênica Para as análises de expressão gênica, após eutanásia, fragmentos do VE foram coletados e armazenados em Freezer a -80°C. O RNA total do VE foi isolado em 1 mL de Trizol (Invitrogen) conforme indicação do fabricante e armazenado a -70°C. As amostras de RNA foramdiluídas na proporção de 1:100 em água, e analisadas por espectrofotometria em260 a 280 nm. Para análise da expressão gênica do miRNA-214 foi utilizado o kit Taqman MicroRNA Assays (Applied Biosystems) seguindo as indicações do fabricante. A quantificação da expressão gênica foi feita em dois passos: primeiro, o DNA complementar específico (cDNA) foi obtido através da transcrição reversa da amostra de RNA total utilizando-se um primer específico para o miRNA analisado do tipo stem-loop e TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit; e segundo, por reação de Real Time-PCR, os produtos de PCR foram amplificados da amostra de cDNA obtida anteriormente, utilizando TaqMan® MicroRNA Assay e TaqMan® Universal PCR Master Mix II. Foi utilizado como controle o normalizador U6 snRNA. As análises foram feitas em equipamento ABI 7500 Real Time-PCR Systems (Applied Biosystems). Análise estatística As pressuposições da análise de variância (ANOVA) – homogeneidade de variâncias entre os grupos e de normalidade das observações, foram checadas e não foram detectadas violações que merecessem atenção. As variáveis se apresentam normais e contínuas. Foi utilizado os testes de Levene, Qui quadrado e Kolmogorov-Smirnov. As comparações entre os valores iniciais e finais de PAS e de TTF de cada grupo experimental foram feitas usando-se o teste t de Student pareado. Para as comparações entre os quatro grupos, usou-se ANOVA two-way , seguida do post-hoc de Tukey. Utilizou-se o programa SigmaPlot (Systat Software, Inc., San Jose, CA, EUA) e adotou-se como nível de significância 5%. Os resultados são apresentados como média ± desvio-padrão da média (DP). Resultados O programa de treinamento físico aplicado aumentou o TTF dos animais normotensos e hipertensos (Figura 1A). A figura 1B apresenta a velocidade de corrida desses animais durante os treinamentos. Os animais hipertensos apresentarammenor peso corporal (PC), igualdade no peso de VE (PVE), maior PVE/PC e nos animais HT maior peso dos ventrículos (PV)/PC em relação aos normotensos (Tabela 1). O treinamento físico aplicado não afetou estes parâmetros. 174