ABC | Volume 111, Nº2, Agosto 2018

Artigo Original Zhong et al Pioglitazona e via de sinalização de VEGFR-2 Arq Bras Cardiol. 2018; 111(2):162-169 ácido linoleico, e 100 M de ácido ascórbico a 37°C em uma atmosfera umidificada com 5 % CO 2 . Para todos os experimentos, as células foramcultivadas a 5×10 4 células/cm 2 (ou outro valor especificado, se o caso). Ensaio de proliferação celular Efeitos de pioglitazona e do inibidor seletivo de VEGFR-2 apatinib (Apexbio Technology LLC, Houston, TX, EUA) sobre a proliferação celular foram medidos por contagem de células coradas por cristal violeta 24 horas após o tratamento, por um contador automático (BioRad). Resumidamente, os cardiomiócitos (5x104 células/poço) foram semeados em placas de 96 poços e cultivados em um meio padrão por 24 horas. Após 24 horas sem soro, os cardiomiócitos foram tratados com angiotensina 0,1 μM (Ang) II por 24 h. Pioglitazona (0, 10 ou 20μM) e inibidor seletivo de VEGFR-2 apatinib (2 μM) foi adicionado ao meio de cultura 2 horas antes da administração de Ang II. Para a marcação com cristal violeta, as células foram lavadas duas vezes com tampão fosfato salina, fixados com metanol 20% por 30 minutos, e corados com solução de cristal violeta 0,2% por 30 minutos à temperatura ambiente sob leve agitação. As células coradas foram lavadas até clara visualização do fundo. O corante cristal violeta foi extraído utilizando-se SDS 1% e as células foram contadas utilizando-se um contador automático. Detecção de apoptose por citometria de fluxo A taxa de apoptose foi determinada por citometria de fluxo com corante anexina V-FITC (AV) combinada com iodeto de propídio (IP). Em resumo, após o tratamento, as células (1‑5 × 105/ml) foram coletadas, lavadas duas vezes com tampão salina fostato, ressuspendidas em 500 μL de tampão de ligação. Em seguida, as células foram incubadas com 10 μL de AV e 5 μL de PI em sala escura e temperatura ambiente por 15 minutos. As células apoptóticas foram identificadas por CMF dentro de 30 minutos. Hipertrofia dos cardiomiócitos Os cardiomiócitos foram semeados a 5 × 10 4 células por poço em placas de 96 poços e a hipertrofia foi avaliada por incorporação de [ 3 H]-leucina, conforme descrito anteriormente. 18 Em resumo, 2 horas após o tratamento com pioglitazona (0-20 μmoL/L) e apatinib (2 μM), Ang II 0,1 μM foi usada para estimular a hipertrofia dos cardiomiócitos, e 1 μCi [3H]-leucina foi simultaneamente adicionada a cada poço. Após estimulação com AngII por 60 horas, as células foram colhidas por precipitação com ácido tricloroacético a 10% em gelo por 30 minutos, antes de ser solubilizado com NaOH 1 moL/L de um dia para outro a 4 o C. As amostras foram neutralizas com HCl 1 moL/L e os níveis de [ 3 H] foram determinados em solução de cintilação usando um contador (beta) para avaliar a incorporação de [ 3 H]-leucina. Análise por Western Blotting Células tripsinizadas foram lisadas em tampão de radioimunoprecipitação, homogeneizadas em gelo, e centrifugadas. O sobrenadante foi diluído com SDS-PAGE 10% e transferido para membranas PVDF (Millipore). As membranas foram bloqueadas com salina tamponada (TBS) contendo 5% de leite desnatado e incubadas com os seguintes anticorpos primários a 4 o C de um dia para o outro: VEGFR-2 (ab39256; 1:1000; Abcam), fosfo-VEGFR-2 (Tyr1175) (#2478; 1:1000; Cell Signaling Technology), Akt (#9272; 1:1000; Cell Signaling Technology), fosfo-Akt (Thr308) (#9275; 1:1000; Cell Signaling Technology), P53 (#9282; 1:1000; Cell Signaling Technology), fosfo-P53 (Ser15) (#9284; 1:1000; Cell Signaling Technology), Bax (#14796; 1:1000; Cell Signaling Technology), anti-mTOR de coelho (#2972; 1:1000; Cell Signaling Technology), anti‑mTOR fosforilado de coelho (Ser2448) (#5536; 1:1000; Cell Signaling Technology), e GAPDH (#2118, 1:1000; Cell Signaling Technology). No dia seguinte, as membranas foram lavadas três vezes com TBS com tween (TBST) por 5 minutos em temperatura ambiente e depois incubadas com anticorpos secundários anti-IgHG de coelhos por 1 hora à temperatura ambiente. Após a incubação, as membranas foram lavadas com TBST e expostas a um filme de raio X. As intensidades da banda no filme foram analisadas por densitometria, e os resultados normalizados para β actina. A proteína GAPDH foi usada como controle de carga. Análise estatística A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa SPSS 13.0. O teste Kolmogorov Smirnov foi usado para se testar a normalidade da distribuição dos dados e o teste de Levene para avaliar a homogeneidade da variância. Todos os dados apresentaram distribuição normal e a homogeneidade da variância foi apresentada comomédia ±DP. O teste ANOVA de um fator (one-way ANOVA) foi usado para comparações entre vários grupos, e o teste de Bonferroni usado para comparações pareadas. Um valor de p<0,05 indicou significância estatística. Resultados VEGFR-2 como melhor alvo potencial para pioglitazona Entre os dez compostos que apresentaram melhor pontuação do PharmMaper, o VEGFR-2 foi o que apresentou maior pontuação. Para entender a interação entre o pioglitazona e o VEGFR-2 e avaliar a energia de ligação, realizamos um estudo de docagem ( docking ) utilizando o GOLD. A conformação ótima de ligação do complexo pioglitazona-VEGFR-2 está apresentada nas Figuras 1A e 1B. O escore ChemScore e a energia de ligação do complexo pioglitazona-VEGFR-2 foram comparáveis à complexa estrutura cristalográfica do inibidor de VEGFR-2. Foram previstas interações de van der Waals da pioglitazona com Val363, Leu428, Cys454, Leu444, Leu310, Phe456, Gly387, Phe383, Val364, e Ile453, e sua ligação com Cys384 e Asp455 por ligações de hidrogênio (Figura 1B). A técnica de Western Blotting foi realizada para avaliar o efeito da pioglitazona sobre a expressão do VEGFR-2 e do fosfo‑VEGFR-2 em cardiomiócitos de ratos neonatos de modo dose-dependente (Figura 1 C). 164