ABC | Volume 111, Nº2, Agosto 2018

Artigo Original Zhong et al Pioglitazona e via de sinalização de VEGFR-2 Arq Bras Cardiol. 2018; 111(2):162-169 Introdução A insuficiência cardíaca (IC) é a consequência mais comum das doenças cardiovasculares e a principal causa de mortalidade em todo o mundo. 1 A base da fisiopatologia da IC é o remodelamento cardíaco, que envolve um número de mudanças celulares incluindo hipertrofia de cardiomiócitos, perda de cardiomiócitos por apoptose, necrose, proliferação de fibroblasto e fibrose. 2 Estudos clínicos recentes demonstraram que o diabetes mellitus (DM) provoca remodelamento cardíaco, incluindo hipertrofia do miocárdio e perda de cardiomiócitos via glicotoxicidade e lipotoxicidade, resultando em IC. 3 Foi demonstrado que um controle rigoroso da glicemia reduz a ocorrência de eventos cardiovasculares importantes incluindo a IC, mas não melhora a taxa de sobrevida global de pacientes com DM tipo 2 em comparação a pacientes que recebem tratamento padrão. 3 As tiazolidinedionas, incluindo a pioglitazona, são amplamente utilizadas no controle glicêmico de pacientes com DM tipo 2 como agonistas de receptores ativados por proliferador de peroxissomo (PPAR)- γ e como agentes quemelhoram a sensibilidade à insulina. No entanto, os riscos cardiovasculares da pioglitazona ainda são controversos. Uma linha afirma que o uso de pioglitazona ou rosiglitazona para controle glicêmico aumenta o risco de IC (OR ≤ 2,1; IC95% 1,08–4,08) com base emmetanálises de ensaios clínicos randomizados. 4-6 A rosiglitazona apresentou maior chance de induzir à IC em comparação à pioglitazona. 7 Além disso, estudos experimentais confirmaram o risco aumentado de IC com tratamento com pioglitazona, uma vez que seu uso aumentou os danos cardíacos em um modelo de IC com ratos induzida por isoproterenol e levou à hipertrofia ventricular nos animais em experimentos sobre toxicidade aguda. 8,9 Uma outra linha defende que o uso de pioglitazona não aumenta significativamente o risco de infarto do miocárdio ou mortalidade por doença cardíaca, baseando-se em dados do estudo PROspective pioglitAzone Clinical Trial In macroVascular Events (PROactive), 10 e que a pioglitazone é capaz de suprimir a hipertrofia cardíaca induzida por sobrecarga por meio da inibição da AKT/GSK3 β e de vias de sinalização da MAPK. 11 Receptores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) são considerados críticos para hipertrofia cardíaca e IC. Três diferentes subtipos foram descritos– VEGFR-1, VEGFR‑2, e VEGFR-3. Estudos recentes mostraram que o VEGFR-1 e o VEGFR-2 são essenciais na regressão e na indução de hipertrofia dos cardiomiócitos, respectivamente, 12 ao passo que o VEGFR-3 mostrou-se benéfico no miocárdio infartado por promover hipertrofia dos cardiomiócitos e melhor sobrevida. 13 Ainda, o VEGFR-2 está envolvido na fase tardia da ruptura da barreira endotelial (células endoteliais da artéria pulmonar e células endoteliais da aorta) causada por altos níveis de produtos de oxidação do 1-palmitoil-2-araquidonil-sn-glicero- 3-fosfatidilcolina, além de contribuir para a formação de fibras de estresse e aumentar a fosforilação de cadeias leves de miosina. 14 A pioglitazona reduziu a expressão de VEGFR-2 em órgãos esplâncnicos e inibiu a neoangiogênese em um modelo de hipertensão portal com ratos, 15 sugerindo um efeito direto sobre a expressão de VEGFR-2. Abordagens com rastreamento reverso – mapeamento farmacofórico reverso e docagem ( docking ) reversa são métodos importantes para identificar novas proteínas alvo para pioglitazona, relacionadas a doenças cardiovasculares. Em nosso estudo, utilizamos o PharmMapper para mapeamento farmacofórico reverso. A estrutura da pioglitazona em formato mol2 foi submetida ao PharmMapper, obtendo-se dez alvos e poses, classificados em ordem decrescente do escore de ajuste ( fit score ). Entre os dez compostos com maiores escores, o VEGFR-2 foi o alvo potencial mais bem ranqueado, dado que será essencial para se compreender a interação entre a droga e o VEGFR-2. Dada a potencial ligação entre a pioglitazona e o VEGFR-2 e seus papeis na hipertrofia e apoptose de cardiomiócitos e na fisiopatologia da IC, nós investigamos, pela primeira vez, se a pioglitazona afeta a hipertrofia e apoptose de cardiomiócitos por regulação da via de sinalização do VEGFR-2. Além disso, espera-se que essa seja uma abordagem promissora para esclarecer o mecanismo potencial do efeito da pioglitazona sobre desfechos cardiovasculares. Métodos Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo comitê para uso e cuidado de animais ( Institutional Animal Care and Use Committee , IACU) do Primeiro Hospital da cidade de Nanping. Preparação das moléculas Para caracterizar os sítios de ligação na identificação de proteínas-alvo, utilizamos o programa Genetic Optimization for Ligand Docking (GOLD) versão 5.3. A estrutura cristalográfica do inibidor do VEGFR-2 (Banco de Dados de Proteínas, PDB, ID:3CP9) foi selecionada como a estrutura inicial 2. OGOLD utiliza um algoritmo genético para ancorar os ligantes no sódio de ligação de proteínas alvo, com flexibilidade conformacional total do ligante e flexibilidade parcial do receptor. A energia de ligação do ligante foi predita pela função ChemScore e energia livre de ligação (ΔG) do GOLD. 16 As moléculas solventes foram removidas da estrutura cristalina e átomos de hidrogênio da proteína foram adicionados. Para a definição dos sítios de ligação, estabeleceu-se que a inclusão de aminoácidos localizados dentro de 10 Å das coordenadas do inibidor na estrutura cristalina. As dez principais poses ancoradas foramobtidas finalizando a simulação uma vez que a raiz do erromédio quadrático (do inglês Root Mean Square Deviation , RMSD) entre qualquer pose de ligante fosse atingido. Os resultados foram visualizados utilizando-se o PyMol versão 1.3 e o LigPlot+ versão 1.4. Isolamento e cultura de cardiomiócitos de ratos neonatos Os cardiomiócitos foram isolados enzimaticamente de ventrículos de ratos Sprague-Dawley com 1 a 3 dias de idade conforme descrito previamente. 17 Doze ratos foram utilizados para a realização de 12 experimentos independentes. Os cardiomiócitos isolados foram semeados em placas de culturas celulares cobertas com 10 g/mL de fibronectina e cultivadas em um meio contendo DMEMF-12 com HEPES (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), 5% de soro de cavalo inativado pelo calor, 100 U/mL de penicilina, 10 μg/mL de estreptomicina, 3 mM de ácido pirúvico, 2 mg/mL de albumina sérica bovina, 100 g/mL de ampicilina, meio insulina- transferrina-selênio (Sigma, St. Louis, MO, EUA), 5 g/mL 163