ABC | Volume 111, Nº2, Agosto 2018

Artigo Original Farsky et al Inflamação persistente após stent Arq Bras Cardiol. 2018; 111(2):134-141 Introdução Estudos retrospectivos sugeriram que a cirurgia de revascularização miocárdica (RVM) após intervenção coronariana percutânea (ICP) possa comprometer os desfechos de curto e longo prazo. 1-7 Estudos prévios demonstraram que a ICP associa-se com maior mortalidade hospitalar, a despeito do perfil de menor risco dos pacientes submetidos a ICP, 3 mas não há consenso na literatura. 8 Uma análise do estudo MASS 9 mostrou que pacientes submetidos a ICP apresentavam maior probabilidade de progressão da doença nas artérias coronárias nativas do que aqueles submetidos a cirurgia de RVM ou tratamento clínico. Durante a ICP, ocorre reação inflamatória focal com ruptura de placa causada pela implantação de stent , mas há controvérsia quanto à persistência dessa reação a longo prazo. Há pouca informação quanto à presença de reação inflamatória sistêmica persistente ou mediadores tissulares na artéria coronária após implantação de stent , assim como quanto à comparação entre artérias coronárias com stent , artérias coronárias sem stent mas tendo o paciente stent em outra artéria e controles. A cirurgia de RVM propicia a oportunidade única de coletar amostras de artérias coronárias para avaliar a reação inflamatória local muito tempo após a implantação de stent . Este estudo visa avaliar a expressão de genes inflamatórios nas células do sangue periférico e a localização da proteína inflamatória em tecido de artéria coronária obtido durante cirurgia de RVM em pacientes com e sem implantação prévia de stent . Vale mencionar que a cirurgia de RVM representa uma oportunidade única de se obter uma diminuta amostra de tecido arterial coronariano para avaliar a reação inflamatória local em seres humanos. Hoje, pacientes submetidos a implantação prévia de stent convencional (SC) e que precisam de cirurgia de RVM mais tarde representam um número significativo dos pacientes em hospitais cardiológicos, em especial em países em desenvolvimento. Nossos resultados podem contribuir para esclarecer a persistência de inflamação local e sistêmica na fase tardia da reestenose de stent . Métodos Casuística Os pacientes admitidos para cirurgia eletiva de RVM com implantação prévia de stent foram consecutivamente incluídos neste estudo após assinar o termo de consentimento livre e esclarecido. O protocolo foi aprovado pelo comitê de ética do Instituto de CardiologiaDante Pazzanese (Protocolo 4059-2011). Este estudo incluiu 67 pacientes submetidos a cirurgia eletiva de RVM como se segue: 41 pacientes com prévia implantação intracoronariana de SC e 26 pacientes sem implantação de stent . Todos os pacientes tinham angina estável e mais de 6 meses de implantação de stent, visando a excluir reestenose em andamento. Os critérios de exclusão consistiram em cirurgias de emergência, síndromes coronarianas agudas e insuficiência renal crônica em uso de diálise devido a reação inflamatória crônica. Coletou-se amostra de sangue periférico no período pré-operatório da veia antecubital, usando tubos PAXgene (PreAnalytiX®, BD Company, RU) para a análise da expressão sistêmica do gene. Durante a cirurgia de RVM, obteve-se, no local da arteriotomia, um diminuto fragmento das artérias coronárias que receberam a ponte, em geral 10 mm depois do sítio de implantação do stent , para avaliar os marcadores de inflamação locais. Todas as amostras de tecido foram imediatamente imersas em solução de formol tamponado para posterior inclusão em blocos de parafina. Alguns dos fragmentos arteriais obtidos não eram adequados para análise histológica, e, portanto, 176 amostras arteriais foram incluídas e agrupadas como se segue: A1- artérias com stent (n = 38); A2- artérias nativas de paciente com stent em outra artéria (n = 68); e A3- artérias de pacientes sem implantação prévia de stent (n = 70). Isolamento de RNA, transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real Extraiu-se o RNA total do sangue periférico coletado em tubos PAXgene (PreAnalytiX®, BD Company, RU) usando o kit PAXgene blood RNA (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha), com posterior quantificação pelo fluorímetro Qubit® 2,0 (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). A integridade do RNA foi analisada com o sistema Tapestation® 2200 e R6K Screen Tape (Agilent Technologies, Inc. RU). O cDNA foi transcrito a partir de 200 ng do RNA total usando High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Realizou-se qPCR em tempo real no sistema de detecção Rotor-Gene® usando-se o kit TaqMan® Fast Multiplex PCR (QIAGENGmbH, Hilden, Alemanha) e primers do sistema Applied Biosystem comercialmente disponibilizado por TaqMan® qPCR (Applied Biosystems, Foster, CA, EUA). Avaliou-se a expressão dos seguintes genes: LIGHT (Hs00542477_m1); IL-6 ( Hs00985639_m1); ICAM ( Hs00164932_m1); VCAM ( Hs00174239_m1); CD40 ( Hs01002913_g1); NFKB ( Hs00231653_m1); TNF (Hs01113624_g1); IFNG ( Hs00989291_m1) e GAPDH (Hs00266705_g1). Para todos os genes, foram construídas curvas-padrão e determinada a inclinação para calcular a eficiência da PCR. Observou-se eficiência quase igual para todos os sistemas primer /sonda. Todas as amostras foram testadas em duplicata usando-se GAPDH como gene de referência, previamente escolhido entre os seis genes mais comuns do miocárdio endógeno com o algoritmo geNorm. 10 As amostras amplificadas após 40 ciclos da PCR foram consideradas negativas e excluídas da analise estatística. A expressão do gene de referência GAPDH foi aplicada para normalização de dados, sendo a relativa expressão de cada mRNA calculada usando-se o método 2 -∆∆CT . 11 Reação imuno-histoquímica Primeiramente, amostras arteriais fixadas em formol e incluídas em parafina foram cortadas com 4-µm de espessura e fixadas em lâminas silanizadas. Seguiram-se desparafinação a 70°C, em forno, por 1 hora, e imersão em três banhos de xilol por 10 minutos. As amostras foram então reidratadas em 135