ABC | Volume 111, Nº1, Julho 2018

Artigo Original Pereira et al. Genes e risco de doença arterial coronariana Arq Bras Cardiol. 2018; 111(1):50-61 Seleção de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) Foram utilizadas duas abordagens para identificar SNPs para ERGs. Na primeira abordagem, fizemos uma busca no banco de dados do National Human Genome Research Institute que incluiu SNPs identificados por GWAs e catalogados com base no fenótipo e/ou traço, pelas palavras chave: “doença arterial coronariana”, “doença coronariana”, “infarto do miocárdio”, e “infarto precoce”. A segunda abordagem incluiu SNPs identificados por abordagens de genes candidatos, incluídos em um ERG publicado para DAC. Os critérios de inclusão incluíram genes descritos em estudos prévios com um Odds Ratio (OR) para DAC ≥ 1,1 e uma frequência do alelomenos comum (MAF, minor allele frequency ) > 5%. Genes com baixo equilíbrio de Hardy-Weinberg (p < 0,002) (após correção de Bonferroni) foram excluídos. No total, 33 SNPs foram selecionados de acordo com suas possíveis funções relacionadas à DAC – ciclo celular, migração celular e inflamação – rs1333049 (9p21.3), rs4977574 (CDKN2B), rs618675 (GJA4), rs17228212 (SMAD3), rs17465637 (MIA3), rs12190287 (TCF21), rs3825807 (ADAMTS7), rs11556924 (ZC3HC1), rs12526453 (PHACTR1); genes envolvidos no status pró-oxidativo (rs1801133 (MTHFR 677), rs1801131 (MTHFR 1298), rs705379 (PON 1), rs662 (PON 192), rs854560 (PON 55), rs6922269 (MTHFD1L); genes associados com fatores de risco modificáveis tais como metabolismo lipídico, hipertensão e diabetes/obesidade – rs3798220 (LPA), rs2114580 (PCSK9), rs20455 (KIF6), rs7412/rs429358 (APOE), rs964184 (ZNF259), rs599839 (PSRC1), rs5186 (AT1R), rs699 (AGT), rs4340 (ACE), rs4402960 (IGF2BP2), rs1326634 (SLC30A8), rs266729 (ADIPOQ), rs7903146 (TCF7L2), rs17782313 (MC4R), rs1801282 (PPARG), rs1884613 (HNF4A), rs8050136 (FTO) e rs1376251 (TAS2R 50) (Tabela suplementar 1). Análises genéticas As análises genéticas foram realizadas no laboratório de genética humana da Universidade da Madeira. O DNA genômico foi extraído de uma amostra de 80 µL de sangue periférico utilizando-se um método padrão com fenol‑clorofórmio. Um ensaio de genotipagem de SNPs pelo sistema TaqMan foi realizado utilizando-se sondas e primers marcados conforme fabricante ( TaqMan SNP Genotyping Assays, Applied Biosystems ). Todas as reações foram realizadas utilizando-se a técnica de PCR em tempo real pelo sistema e programa Applied Biosystems 7300 ( Applied Biosystems , Foster City, EUA) sem nenhum conhecimento prévio dos dados clínicos dos indivíduos. A qualidade das técnicas de genotipagem foi controlada pela inclusão de um controle branco (non‑template) em cada placa de 96 poços. Todos os ensaios TaqMan foram realizados com duplicatas (cegas), correspondendo a 20% das amostras. Alguns genótipos de SNPs foram confirmados aleatoriamente pelo procedimento convencional de sequenciamento direto do DNA, sendo que 10-15% de todas as amostras foram reamplificadas por sequenciamento. As taxas de acurácia ( call rates ) para SNPs no ERG foram 98-100%; uma taxa de 95% foi estabelecida como controle de qualidade. Cálculo do escore de risco genético Avaliamos vários modelos para elaborar o ERG com base em escores ponderados e não ponderados, considerando cada padrão de herança de cada locus gênico. Um escore aditivo (ERGA) foi gerado, isto é, para cada uma das 31 variantes, foi estabelecido um escore de 0, 1 e 2 com base na existência de 0, 1 ou 2 alelos de risco, calculando‑se a soma acumulada dos alelos de risco nessas variantes. Cada indivíduo poderia receber um ERG de 0 a 62. Além disso, um ERG multiplicativo (ERGM) foi calculado, multiplicando-se o risco relativo para cada genótipo. Para validar o cálculo do escore de risco, selecionamos uma amostra aleatória de 597 pacientes (20%). Análise estatística As variáveis categóricas foram expressas em frequências e porcentagens e comparadas pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. As variáveis contínuas foram expressas em média ± desvio padrão (DP) ou mediana (1º quartil – 3º quartil) e comparadas pelo teste t para amostras não pareada ou o teste de Mann-Whitney, conforme apropriado. O teste de Kolmogorov-Smirnov e o teste de Levene foram usados para testar normalidade e homogeneidade das variáveis. Todas as análises foram consideradas significativas se os valores de p fossem menores que 0,05. Regressão logística binária foi usada para determinar o efeito (combinado e separado) das variáveis sobre o risco para DAC angiográfica. O ERG foi delineado como uma variável contínua e em quartis, usando-se o primeiro quartil como categoria de referência. As análises multivariadas foram usadas para ajuste do modelo quanto a 7 covariáveis também associadas com DAC. Desenvolvemos características de operação do receptor (curvas ROC) e calculamos a área sob a curva (AUC) para modelos de regressão logística incluindo FRTs com e sem o ERG (quartis). As curvas ROC foram comparadas em pares usando o teste DeLong. 11 A calibração do modelo foi testada pelo teste de Hosmer-Lemeshow. Um valor de p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Colinearidade entre as variáveis foi medida avaliando-se tolerância e fator de inflação da variância (FIV). Associações dos SNPs com DAC foram consideradas significativas para p < 0,05 e em conjunto com os modelos de ERG para p < 0,0015 aplicando-se a correção de Bonferroni. Para MAF de 30%, o estudo apresentou poder de 70% para detectar um OR para DAC de 1,3 e > 90% para OR > 1,35, para alfa bicaudal < 0,05 para 2000 casos e 1000 controles. Esses cálculos foram realizados usando o programa G power Statistical Power Analyses . O potencial do ERG em melhorar a estratificação de risco individual foi medido pelo método net reclassification improvement (NRI), 12 definido como a porcentagemde indivíduos emcada subgrupo quemudaramde categorias quando umnovo modelo de ERG foi adicionado. Ainda, a melhora integrada de discriminação ( integrated discrimination improvement , IDI), definida como a melhora incremental no valor prognóstico do ERG, foi comparada entre casos e controles. O NRI foi calculado para variáveis categóricas e não categóricas (contínuas) 52