ABC | Volume 110, Nº6, Junho 2018

Artigo Original Oishi et al Disfunção endotelial e pressão arterial em ratos Arq Bras Cardiol. 2018; 110(6):558-567 completar o volume de 0,9 mL. Uma amostra do extrato de tecido (20-100 µL) foi adicionada, e o volume final ajustado a 1 mL com água. Os brancos foram preparados substituindo-se o extrato de tecido por água. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente até o final da reação (40 minutos), e a absorbância a 560 nm foi medida. Nitrito e nitrato séricos (NOx) Os níveis de óxido nítrico sérico foram obtidos medindo‑se as concentrações séricas de seus produtos finais estáveis nitrito (NO 2 - ) e nitrato (NO 3 - ), coletivamente conhecidos como NOx, conforme descrito anteriormente. 15 O método de quimioluminescência de NO/ozônio foi realizado utilizando‑se o aparelho de análise de NO (NO Analyzer 280i, Sievers, Boulder, CO, EUA). Determinação de adiponectina e citocinas inflamatórias A quantificação de adiponectina e das citocinas inflamatórias – fator de necrose tumoral alfa (TNF- α ), interleucina 6 (IL-6) e proteína C- reativa (PCR) no soro foi realizada utilizando-se o kit de ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA). IL-6 e TNF- α foram avaliados utilizando-se kits comerciais OptEIA (BD Biosciences, Pharmingen, EUA). A adiponectina e a PCR foram analisadas utilizando-se kits Duo Set (R&D Systems, EUA). Todos os kits foram usados de acordo com as instruções do fabricante, e os resultados de todas as citocinas avaliadas expressos em pg/mL. Avaliação morfológica e histológica Os segmentos da aorta foram rapidamente limpos de tecidos adjacentes e sangue, cortados em anéis e fixados em formalina 37% e em blocos de parafina. Em seguida, seções de 4 µm de espessura foram cortadas com um micrótomo (Leitz 1512, IMEB, EUA), transferidas para lâminas de microscópio e coradas com hematoxilina e eosina usando métodos padrões. Imagens de seções transversais dos segmentos arteriais foram capturadas usando uma câmera conectada a um microscópio ótico (Leica DM 2000). O diâmetro externo (DE) foi obtido medindo-se as superfícies da túnica adventícia e do diâmetro interno (DI) a partir da superfície endotelial. A espessura da camada média foi obtida dividindo-se a diferença (DE - DI) por dois ( δ = ED - ID/2). A razão camada média/lúmen foi calculada a partir dos dados da área. As imagens foram analisadas utilizando-se o programa ImageJ, conforme descrito anteriormente. 16 Análise estatística A normalidade da distribuição (de todas as variáveis quantitativas e contínuas) foi testada pelo teste de Kolmogorov‑Smirnov. Foi necessária uma amostra de 7 animais em cada grupo para conferir um poder estatístico de 85% com um alfa bicaudal de 0,05 para pD2 e de 90% para todas as outras variáveis analisadas neste estudo. As diferenças entre os grupos CT e DHL foram comparadas por análise de variância (ANOVA) de dois fatores commedidas repetidas. Quando diferenças eram apontadas, a análise post‑hoc de Newman‑Keuls foi usada com significância estatística estabelecida em p < 0,05. Esses dados são expressos em média ± DP (programa Statistica 7.0, StatSoft. Inc, EUA). Os dados de reatividade vascular de pD2 e MaxE foram expressos em média ± DP com p < 0,05 estabelecido como significância estatística (Graphpad Prism 3.0). A correlação de Pearson foi realizada entre pD2 e a PAS, pD2 e VAT, pressão arterial e VAT, IL-6 e pD2, TNF- α e pD2, CRP e pD2, e entre adiponectina e pD2, com significância estatística de 5%. Resultados Tecido adiposo visceral total (TAV) A soma dos pesos dos tecidos adiposos retroperitoneal, visceral e epididimal foi maior no grupo DHL que no grupo CT na sexta semana. Na semana 24, o peso do tecido adiposo foi 300%maior no grupo DHL que no grupo CT. TAV no grupo CT aumentou na semana 12 em comparação à semana 6, mas permaneceu inalterado até o final do experimento (Figura 1). Status inflamatório As citocinas inflamatórias IL-6, TNF- α e PCR estavam aumentadas no soro dos animais do grupo DHL nas semanas 6, 12, 18 e 24 em comparação ao grupo CT (Figuras 2 A, B, C). Por outro lado, os níveis de adiponectina sérica diminuíram no grupo DHL após 6, 12, 18 e 24 semanas de experimento (Figura 2D). No grupo CT, não houve alteração nos níveis de citocina. Reatividade vascular Não houve diferenças no relaxamento dependente do endotélio induzido pela acetilcolina (pD2) no grupo CT durante todo o período de experimento. Por outro lado, pD2 foi deficiente nas aortas dos animais obesos nas semanas 6, 12, 18 e 24 em comparação aos ratos controles. Além disso, observamos uma diminuição no pD2 durante o período experimental no grupo DHL (Figuras 3B, C). Não foram observadas diferenças no efeito máximo de relaxamento (Emax) nos grupos CT e DHL. Nos anéis aórticos desprovidos de endotélio, não foram observadas diferenças de pD2 ou Emax ao relaxamento independente de endotélio induzido por SNP nos grupos CT e DHL em todas as semanas (Tabela 1). Houve uma forte correlação negativa entre pD2 e PAS (r = -0,722, p <0,01). Alémdisso, encontramos uma correlação negativa entre pD2 e TAV (r = -0,729, p < 0,01), entre pD2 e citocinas inflamatórias (pD2 e IL-6, r = -0,74; pD2 e TNF- α , r = -0,86; pD2 e CRP, r = -069, p < 0,05), e uma correlação positiva entre pD2 e adiponectina (r = 0,77, p < 0,01). Óxido nítrico sérico (NO) e peroxidação lipídica da aorta A partir da quantificação dos metabólitos de NO, observamos que os níveis de NO diminuíram na sexta semana nos ratos DHL e permanecerammais baixos durante o período experimental em comparação ao grupo CT. O tempo de 560