ABC | Volume 110, Nº4, Abril 2018

Artigo Original Nascimento et al Vimentina e Anticorpos Anti-Vimentina na Doença de Chagas Arq Bras Cardiol. 2018; 110(4):348-353 Introdução A doença de Chagas ou a tripanossomíase americana é uma infecção parasitária peculiar, uma vez que o Trypanosoma cruzi é um parasita intracelular único que causa a presença citoplasmática de formas de amastigota, um evento celular raro na natureza, já que o citoplasma é geralmente livre de parasitas em quase todas as infecções intracelulares. 1 Após sua reprodução, o parasita tem um conjunto de enzimas, como as sialidases, que transferemmoléculas da célula hospedeira para a sua superfície, permitindo a evasão celular sem interrupção. 2 Todos esses processos poderiam alterar o citoesqueleto celular e suas proteínas, provavelmente gerando sinais nas células hospedeiras que alteram a síntese proteica de proteínas estruturais. A vimentina é uma proteína estrutural importante da célula, um componente de filamentos celulares intermediários imersos no citoplasma. 3 A vimentina é expressa no músculo cardíaco normal e seus tumores, e os autoanticorpos contra a vimentina são encontrados na rejeição do aloenxerto 4 ou em modelos cardíacos de rejeição de aloenxerto. 5 A vimentina é imitada por algumas proteínas bacterianas e anticorpos anti‑vimentina são produzidos em doenças cardíacas autoimunes, como a febre reumática. 6 Neste trabalho, estudamos a distribuição de vimentina em células LLC-MK2 infectados com T.cruzi e anticorpos anti-vimentina em soros de várias imagens clínicas de tripanossomíases americanas, a fim de elucidar qualquer envolvimento da vimentina na resposta humoral dessa patologia. Métodos Parasitas e amostras de soro Os epimastigotas de Trypanosoma cruzi foram cultivados a partir da cepa Y rotineiramente mantida em nosso laboratório em meio de cultura de Infusión de Hígado y Triptosa (IHT) suplementada com 10% de soro de vitelo fetal. Os tripomastigotas de T. Cruzi foram obtidos a partir de sobrenadantes de cultura de células LLC-MK2 previamente infectadas. O anticorpo monoclonal Anti-Vimentina de rato (V6630) e a vimentina da lente bovina foram obtidos comercialmente (Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA). Soro de um paciente com tripanossomíase americana cardíaca crônica foi usado como anticorpo anti- T.cruzi . Foram utilizados soros humanos de pacientes com Tripanossomíase americana e controles do biorepositório de pacientes com T.cruzi , ESUmezawa, Lab.Protozoology, foram recuperadas amostras de E.S.Umezawa, Lab.Protozoology IMTSP, serologicamente caracterizadas em testes sorológicos TESA específicos e publicadas anteriormente em vários artigos, compreendendo 26 soros de doença aguda, 33 de doença cardíaca isolada, 17 de doença digestiva isolada, 20 sem doença clínica (doença assintomática) e 40 soros de pacientes fora da área endêmica. Todos os dados clínicos forammantidos pelo médico assistente e não estão disponíveis para este estudo. Expressão e morfologia do antígeno Todos os testes morfológicos foram realizados em um microscópio epifluorescente Zeiss Axioplan com filtros de fluoresceína. Para a detecção do antigénio, fixamos células de controle LLC-MK2, células LLC-MK2 infectadas com T.cruzi e epimastigotas de T. Cruzi e impregnamos a superfície celular com Triton X-100 7 com anticorpos anti Vimentin ou anti T.cruzi como é descrito em outra parte. Após este passo, os anticorpos ligados foram revelados com um conjugado de fluoresceína adequado, lavados cuidadosamente e montados em glicerina para observação. Os campos representativos foram digitalizados no campo de alta potência com uma câmera Canon. TESA e ELISA vimentina O antígeno excretado secretado de tripomastigotas de T.cruzi foi obtido como descrito em outra parte. 8 TESA (1/80) e Vimentina (0,06 ug / ml) em carbonato 0,05 M pH 9,6 foram adsorvidos durante a noite aos poços de placas ELISA de 96 poços (Corning Inc. New York, EUA). Após a lavagem e bloqueio com PBS Tween 20, 0,05% mais 5% de leite ou 0,5% de BSA, incubaram-se diluições adequadas de soro (1/50 vimentina e 1/200 TESA) durante uma hora. Após lavagens adicionais, se adicionou diluição adequada do conjugado de peroxidase durantemais uma hora, se lavou e ligou o conjugado desenvolvido durante 1 h com ortofenilenodiamina e peróxido de hidrogénio. Após 30 minutos a 37°C, a reação foi parada comHC1 4N e a absorvência de 492 nm foi determinada num leitor de microplacas (Multiskan-Titertek II). Análise estatística Todos os dados quantitativos, como O.D. ELISA, foram analisados usando ANOVA após o teste Levene para verificação de variância, com comparações intragrupo pelo teste de Bonferroni, se houver uniformidade de variâncias. Na ausência dessa homogeneidade, os dados foram analisados por testes de Kruskal-Wallis com pós-testes de Dunns. Optamos pela representação gráfica de dados individuais em trama de pontos com associação de média e SEM para comparação. A análise qualitativa, como frequência de soros positivos no grupo, foi feita por testes exatos de Fisher em duas análises de grupo. Também incluímos 95% de intervalo de confiança da proporção estimada. A diferença significativa foi considerada quando a probabilidade de igualdade (H1 = H0) foi inferior a 0,05 (p ≤ 0,05), utilizando análise de duas colunas e potência superior a 90%. Utilizamos o pacote estatístico GraphPad Prism 7.0 para todas as análises estatísticas e plotagem. Resultados Analisamos a distribuição de Vimentina em células de cultura usando ensaios de fluorescência indireta como descrito em Métodos, utilizando como controle externo soros de anti- T. Cruzi , derivado a partir de pacientes com infecção crónica por identificação dos parasitas no mesmo modelo, como pode ser visto na Figura 1. As células LLC-MK2, a célula hospedeira utilizada para o crescimento intracelular de T. Cruzi , apresentaram coloração citoplasmática discreta e uniforme na maioria das células (Figura 1A). Essas células não são reativas aos anticorpos anti-T-cruzi, sem qualquer coloração (Figura 1B). Após a infecção e o crescimento de amastigotas de T. Cruzi , essas células expressam quantidades elevadas de vimentina, com forte coloração de citoplasma 349