ABC | Volume 110, Nº1, Janeiro 2018

Artigo Original Hu et al Modulação da melatonina no cálcio nos cardiomiócitos Arq Bras Cardiol. 2018; 110(1):44-51 durante 10 min à temperatura ambiente. Finalmente, foram lavadas três vezes com PBS. As amostras montadas foram analisadas utilizando microscopia confocal. Detecção da concentração intracelular de Ca 2+ OCa 2+ intracelular foi medido usando o corante fluorescente dependente de cálcio Fura-2 de acordo com as instruções do fabricante. As culturas de H9C2 foram transferidas para 1 mL de DMEM fresco contendo 5 μL de Fura-2-acetoxi-metiléster (AM; 10 μM; Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e incubadas em uma incubadora de CO 2 a 37° C durante 1 h. As células carregadas com Fura-2 foram então colocadas na platina de ummicroscópio confocal (Olympus) e visualizadas usando uma objetiva de imersão em óleo de 60 ×. Western blots Após os tratamentos apropriados, as células cultivadas foram lisadas com tampão de lise RIPA (Beyotime, China) durante 30 min e centrifugadas a 14 000 xg durante 30 min. Quantidades iguais de proteína foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio ao 10% e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Millipore). Após ter sido bloqueada com 5% de leite em solução salina tamponada com tris contendo 0,05% de Tween20 (TBST) à temperatura ambiente durante 1 h, a membrana foi incubada a 4ºC durante a noite com os seguintes anticorpos primários: t-ERK1 (1: 2000, Abcam), p‑ERK1 (1: 1000, Abcam), IP3R (1: 1000, Abcam) e SERCA (1: 1000, Ab-cam). Depois de ser lavada com TBST e incubada adicionalmente com o anticorpo secundário apropriado a 37°C durante 60 min, as blots foram visualizadas com um reagente de quimioluminiscência melhorada (ECL). Modelo de isquemia / reperfusão miocárdica (I/R) e tratamento com melatonina Ratos machos Sprague-Dawley (SD) (250 ± 10 g) foram adquiridos do Centro Animal Experimental, do Hospital Geral PLA da China. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal do Hospital Geral do PLA chinês. Os ratos foram divididos nos seguintes grupos (n = 5 em cada grupo): (1) Grupo de controle, (2) Grupo I/R, (3) Grupo I/R +Melatonina, (4) I/R +Melatonina + PD98059. Os ratos foram anestesiados intraperitonealmente com pentobarbital sódico (50 mg/kg). Os animais foram então incubados e ventilados por um respirador regulado por volume durante a cirurgia. Após uma toracotomia lateral esquerda e pericardectomia, a artéria coronária esquerda foi identificada e ligada suavemente com uma sutura de Prolene 6.0. O IAM bem-sucedido foi confirmado pela elevação típica do segmento ST na eletrocardiografia. A isquemia miocárdica durou 30 minutos e a reperfusão 2 horas. Melatonina recentemente preparada (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi administrada por via intraperitoneal em uma dose de 20 mg/kg 12 horas antes do IM. PD98059 (inibidor ERK1, Sigma, EUA) foi administrado com injeção intraperitoneal em uma dose de 5 mg/kg 4 horas antes do tratamento com melatonina. No final do período de reperfusão, os corações foram excisados para a preparação de seções (4 μm de espessura) para detectar a expressão de SERCA e IP3R por coloração de imunofluorescência. Detecção de expressão do miocárdio SERCA e IP3R por imunofluorescência Depois de serem tratadas como foi mencionado acima, as secções do coração foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 15 minutos à temperatura ambiente, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 durante 10 min e depois bloqueadas com 5% de BSA durante 1 h. Em seguida, as amostras foram incubadas durante a noite a 4°C com anticorpo monoclonal anti-rato SERCA (1: 100; Abcam, Cambridge, EUA). Depois de serem lavados com PBS por três vezes, as amostras foram incubadas com IgG policlonal de cabra anti-rato (1: 400; Abcam, Cambridge, EUA) à temperatura ambiente no escuro durante 2 h. Para contra‑coloração nuclear, as amostras foram incubadas com4', 6-diamidino-2-fenilidona (DAPI, Sigma, EUA) durante 5 min. Finalmente, as imagens de imunofluorescência foram obtidas por microscópio de fluorescência invertida (Olympus, Tóquio, Japão). Análise estatística Os dados foram descritos como a média ± DP de pelo menos três experimentos independentes analisados. As diferenças entre mais de dois grupos foram avaliadas através de ANOVA de 1 via (todos os dados atendiama homogeneidade de variâncias e distribuição normal), e o método LSD foi usado para comparar a diferença estatística na análise pós‑hoc. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas com SPSS para Windows versão 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Resultados A melatonina promoveu ativação de ERK1 em cardiomiócitos contra H/R Às 4 horas após a reoxigenação, investigamos o efeito da melatonina na fosforilação de ERK1 (p-ERK1) usando Western blot. O nível de expressão de p-ERK1 não mostrou diferença significativa entre o controle e o grupo H/R. A melatonina promoveu significativamente a expressão de p-ERK1 em cardiomiócitos a qual foi revertida por PD98059 (inibidor ERK1) (Figura 1). A melatonina impede a apoptose induzida por H/R de cardiomiócitos via ERK1 in vitro A apoptose das células H9C2 foi detectada às 4 h após a reoxigenação por coloração TUNEL. Os resultados demonstraram que H/R induzem apoptose de células H9C2 in vitro. O pré-tratamento commelatonina diminuiu a apoptose induzida por H/R de H9C2. Os resultados mostraram que a porcentagem de células apoptóticas foi obviamente maior no grupo H/R em comparação com o grupo controle, porém, que foi significativamente menor no grupo da melatonina do que o grupo H/R. PD98059 (Inibidor ERK1) reduziu o efeito da melatonina na prevenção da apoptose dos cardiomiócitos contra H/R (Figura 2). 46